Generación experimental de carcinoma asociada a los fibroblastos (CAF) a partir de fibroblastos humanos mamarios
Summary
Carcinoma asociados fibroblastos (CAF), rica en miofibroblastos presentes en el estroma tumoral, juegan un papel importante en la conducción de la progresión del tumor. Hemos desarrollado un modelo de tumor coimplantation xengraft para generar experimentalmente CAF a partir de fibroblastos humanos mamarios. El protocolo describe cómo establecer miofibroblastos CAF que adquirir la capacidad de promover la génesis tumoral.
Abstract
Los carcinomas son los tejidos complejo compuesto por células neoplásicas y un compartimento no canceroso conocido como el "estroma". El estroma está formado por la matriz extracelular (MEC) y una variedad de células mesenquimales, incluyendo fibroblastos, miofibroblastos, células endoteliales, pericitos y leucocitos 1-3.
El estroma asociado al tumor es sensible a importantes señales paracrinas liberada por las células de carcinoma vecinos. Durante el proceso de la enfermedad, a menudo se convierte en el estroma poblada por carcinoma asociado a los fibroblastos (CAF), incluyendo un gran número de miofibroblastos. Estas células han sido previamente extraídos de diferentes tipos de carcinomas humanos para su cultivo in vitro. Una subpoblación de CAF se distingue a través de su regulación de la actina de músculo liso α-(α-SMA) la expresión de 4,5. Estas células son un sello de "fibroblastos activados" que comparten propiedades similares a miofibroblastos commonly observada en los tejidos dañados y fibrosis 6. La presencia de este subgrupo miofibroblástico CAF está muy relacionada con tumores malignos de alto grado y se asocia con mal pronóstico en los pacientes.
Muchos laboratorios, incluido el nuestro, han demostrado que la CAF, cuando se les inyectó células de carcinoma en ratones inmunodeficientes, son capaces de promover la génesis tumoral sustancial 7-10. CAF preparado a partir de pacientes con carcinoma, sin embargo, con frecuencia sufren senescencia durante la propagación de la cultura limitar la extensión de su uso a través de la experimentación en curso. Para superar esta dificultad, hemos desarrollado una nueva técnica para generar experimentalmente inmortalizado humanos líneas de células mamarias CAF (exp-CAF) a partir de fibroblastos humanos de mama, con un pecho coimplantation modelo de xenoinjerto tumoral.
Con el fin de generar exp-CAF, los padres fibroblastos de mama humano, procedente de los tejidos mamoplastia de reducción, fueron los primeros immortalised con hTERT, la subunidad catalítica de la telomerasa holoenzyme, y para expresar las buenas prácticas agrarias y un gen de resistencia a la puromicina. Estas células fueron coimplanted con células MCF-7 humanas de carcinoma de mama que expresan un oncogén ras activado (MCF-7-ras células) en un xenoinjerto de ratón. Después de un período de incubación in vivo, el primer inyectado fibroblastos humanos mamarios se extrajeron de los xenoinjertos de tumores en la base de su resistencia a la puromicina 11.
Hemos observado que el residente de fibroblastos humanos mamarios se han diferenciado, la adopción de un fenotipo tumoral miofibroblástico y adquirió propiedades que promueven durante el curso de la progresión del tumor. Es importante destacar que estas células, que se define como exp-CAF, imitan el fenotipo de promoción tumoral miofibroblástico de CAF aislado de los carcinomas de mama disecados de los pacientes. Nuestra xenoinjerto de tumor derivado de exp-CAF por lo tanto, proporcionar un modelo eficaz para estudiar la biología de la CAF en breas humanost carcinomas. El protocolo descrito también se puede extender para la generación y caracterización de diferentes poblaciones CAF derivados de otros tipos de carcinomas humanos.
Protocol
Discussion
La falta de marcadores específicos de la CAF y el nivel de heterogeneidad observada entre CAF hacer la caracterización de este tipo de células por sí un desafío. CAF estudiar in vitro también se ha visto obstaculizado por la complicación adicional de que estas células envejecen y dejan de proliferar en cultivo durante un largo período. Nuestro intento anterior para inmortalizar directamente CAF primario utilizando un retrovirus construir hTERT cDNA no tuvo éxito. Por lo tanto, a investigar más a fond…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos al Dr. Robert A. Weinberg (Whitehead Institute for Biomedical Research, Cambridge) por su generoso apoyo y supervisión de este trabajo y el Sr. Kieran Mellody (Universidad de Manchester, Manchester) para la edición crítica de este manuscrito. Este proyecto fue apoyado por la investigación del Reino Unido (CR-Reino Unido) el número de concesión C147/A6058 (AO)
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
| DMEM | Invitrogen | 61965-026 | ||
| Fetal calf serum | GIBCO | 10270 | ||
| Penicillin-streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | ||
| Collagenase type I | Sigma | C0130-1G | ||
| hyaluronidase | Sigma | H4272 | ||
| Vimentin (V9) antibody | Novocastra Laboratories | NCL-L- VIM-V9 |
||
| Tenascin C (BC-8) antibody | a gift from |
|||
| α-SMA-Cy3 (1A4) antibody | Sigma | C6198 | ||
Prolyl-4-hydroxylase |
Dako | M0877 | ||
| (5B5) antibody | ||||
| Collagen type1 1A antibody | Sigma | HPA011795 | ||
| Pan-cytokeratin antibody | Sigma | C5992 | ||
| Fibronectin antibody | BD Biosciences | 610077 | ||
S100A4/FSP-1 (fibroblast- specific protein-1) antibody |
Dako | A5114 | ||
Fibroblast surface protein (clone 1B10) antibody |
Abcam | ab11333 | ||
| MSCV-IRES-GFP construct | Request to the the authors | |||
| pBabe-puro construct | Purchase from Addgene |
|||
| Puromycin | Sigma | P8833 | ||
| DAPI | Sigma | D9564 | ||
| 15 ml conical tube | Corning | 430766 | ||
| Nude mouse | Taconic | NCRNU-F | Female NCr nude | |
| C3H/10T1/2 cells | ATCC | CCL-226 |
References
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