Chromatografische zuivering van sterk actieve gist Ribosomen

Samenvatting

Verontreiniging van de voorbereidingen van eukaryotische ribosomen gezuiverd door middel van traditionele methoden door co-zuiveren nucleasen en proteasen negatief effect op de downstream-biochemische en structurele analyses. Een snelle en eenvoudige chromatografische zuivering methode wordt gebruikt om dit probleem op met behulp van gist ribosomen als een modelsysteem op te lossen.

Samenvatting

Eukaryotische ribosomen zijn veel meer labiel in vergelijking met hun eubacteriële en archael tegenhangers, waardoor die een belangrijke uitdaging voor onderzoekers. Bijzonder lastig is het feit dat lysis van de cellen een groot aantal proteasen en nucleasen die kunnen afbreken ribosomen releases. Zo is het belangrijk om ribosomen te scheiden van deze enzymen zo snel mogelijk. Helaas, conventionele differentieel ultracentrifugatie methoden laat ribosomen blootgesteld aan deze enzymen voor onaanvaardbaar lange tijd, invloed zijn op hun structurele integriteit en functionaliteit. Om dit probleem, wij maken gebruik van een chromatografische methode met behulp van een cysteïne gebracht Sulfolink hars. Deze eenvoudige en snelle toepassing vermindert co-zuiverende proteolytische en nucleolytische activiteiten, het produceren van hoge opbrengsten van een intact, zeer biochemisch actieve gist ribosomen. Wij stellen voor dat deze methode ook moeten gelden voor zoogdieren ribosomen. De eenvoud vande methode, en de verbeterde zuiverheid en activiteit van chromatografisch gezuiverd ribosoom is een belangrijke technische vooruitgang voor de studie van eukaryotische ribosomen.

Protocol

1. De voorbereiding van een cysteine ​​geladen Sulfolink hars

1. Bereid Sulfolink hars (Pierce) bij kamertemperatuur.
2. Plaats een totaal van 10 ml van een 50% suspensie van Sulfolink koppeling gel zoals geleverd door de fabrikant in twee 10 ml plastic flacons met 5 ml verdeeld in elke flacon.
3. Kort centrifuge flacons bij 850 xg en verwijder voorzichtig supernatant.
4. Was de gel drie keer in koppeling-buffer (50 mM Tris, pH 8,5, 5 mM EDTA) door resuspenderen de kralen in 5 ml, centrifugeren even op 850 xg en het verwijderen van het supernatant met een pipet.
5. Voeg vervolgens vijf ml van een 50 mM oplossing van L-cysteïne in k....

Discussie

Ribosoom zuivering protocollen in principe te betrekken lyseren cellen, het oogsten een cytosolische fractie van een lage snelheid draaien, en dan pelletering ribosomen door de hoge snelheid centrifugeren ^1. Terwijl een paar nieuwe methoden zijn gebruikt voor het zuiveren van bacteriële ribosomen, had hetzelfde niet geldt voor eukaryoten ^2-4. Hoewel de extra stappen zijn toegevoegd aan de jaren, zoals het zout wast, en glycerol kussens (bijv. zie ^5), hebben biochemische en structurele st.......

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Naam van het reagens	Vennootschap	Catalogus nummer
Sulfolink Koppeling hars	Doorboren	20402
Mini bead-beater 16	Biospec	607
Optima Max E ultracentrifuge	Beckman Coulter
Legende RT	Sorvall
0,5 mm Glas kralen	Biospec	11079105
Tris	Sigma-Aldrich	252859
EDTA	Sigma-Aldrich	E9884
DTT	Sigma-Aldrich	43815
HEPES	Sigma-Aldrich	54459
NH 4 Cl	Sigma-Aldrich	A9434
KCl	Sigma-Aldrich	60128
Mg (OAc) 2	Sigma-Aldrich	M5661
KOH	Sigma-Aldrich	221473
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516
Puromycine	Sigma-Aldrich	P7255
GTP	Fermentas	R0461