Yüksek Aktif Maya Ribozomlar Kromatografik Arıtma

Özet

Ortak arıtma nükleazlar ve proteazlar tarafından geleneksel yöntemlerle saflaştırılmış ökaryotik ribozomlar hazırlıkları kontaminasyonu mansap biyokimyasal ve yapısal analizleri olumsuz etkiler. Maya ribozomlar bir model sistem olarak kullanarak bu sorunu çözmek için basit ve hızlı bir kromatografik saflaştırma yöntemi kullanılır.

Özet

Ökaryotik ribozomlar, böylece araştırmacılar için önemli bir meydan okuma poz eubacterial ve archael muadillerine göre çok daha dayanıksız. Özellikle sorunlu hücrelerin parçalanması, proteaz ve ribozomlar düşürebilir nükleazlar çok sayıda serbest olduğu bir gerçektir. Bu nedenle, mümkün olduğunca çabuk bu enzimler ribozom ayırmak için önemlidir. Ne yazık ki, geleneksel diferansiyel Ultrasantrifügasyon yöntemleri, yapısal bütünlüğünü ve işlevselliğini etkileyen bu enzimler zaman kabul edilemeyecek kadar uzun süre maruz ribozomlar bırakır. Bu sorunu çözmek için, bir sistein ücret Sulfolink reçine kullanarak kromatografik yöntem kullanmaktadır. Bu basit ve hızlı uygulama, sağlam, yüksek biyokimyasal aktif maya ribozomların yüksek verim üreten ortak arıtma proteolitik ve nucleolytic faaliyetleri, önemli ölçüde azaltır. Bu yöntem aynı zamanda memeli ribozomlar için geçerli olması gerektiğini düşündürmektedir. Sadeliğiyöntemi ve ökaryotik ribozomlar çalışma için önemli bir teknik ilerleme, kromatografik saflaştırılmış ribozom gelişmiş saflık ve aktivite gösterir.

Protokol

1. Bir sistein hazırlanması Sulfolink reçine ücret

1. Oda sıcaklığında Sulfolink reçine (Pierce) hazırlayın.
2. Her bir şişenin içine dağıtılan 5 ml, 10 ml% 50 olarak iki adet 10 ml plastik şişeleri, üretici tarafından sağlanan Sulfolink kaplin jel bulamaç toplam yerleştirin.
3. Kısaca 850 xg'de şişeleri santrifüj ve dikkatle süpernatantlar kaldırmak.
4. 5 ml boncuklar resuspending xg 850 kısaca santrifüj ve pipet ile süpernatantı çıkarmadan kaplin tamponu (50 mM Tris, pH 8.5, 5 mM EDTA) jel üç kez yıkayın.
5. Her tüp kaplin tamponu 50 mM L-sistein çözüm beş ml ekleyin ve 1 saat 25 bulamaç karıştırın ° C
6. Yukarıda adım 1.4....

Tartışma

Ribozom arıtma protokolleri temelde düşük hızda spin sitozolik bir fraksiyonu hasat parçalama hücreleri içerir ve daha sonra yüksek hızda ^santrifüj 1 ribozomlar peletleme . Bakteri ribozomları temizlemek için bir kaç yeni yöntemler kullanılmış olsa da, aynı ökaryotlar ^2-4 için doğru değildi. Maya ribozomlar biyokimyasal ve yapısal çalışmalar ek adımlar yaş, örneğin tuz yıkama ve gliserol minderler ^{(örneğin: 5)} boyunca eklenmiş olmasına rağmen, büyük olasılıkla, arıtma işlemi sırasında en.......

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Reaktifi Adı	Şirket	Katalog numarası
Sulfolink Kaplin reçine	Delmek	20402
Mini boncuk-çırpıcı 16	Biospec	607
Optima Max E ultrasantrifüjdeki	Beckman Coulter
Legend RT	Sorvall
0,5 mm Cam boncuklar	Biospec	11079105
Tris	Sigma-Aldrich	252859
EDTA	Sigma-Aldrich	E9884
DTT	Sigma-Aldrich	43815
Hepes	Sigma-Aldrich	54459
NH 4 Cl	Sigma-Aldrich	A9434
KCl	Sigma-Aldrich	60128
Mg (oac) 2	Sigma-Aldrich	M5661
KOH	Sigma-Aldrich	221473
Gliserin	Sigma-Aldrich	G5516
Puromycin	Sigma-Aldrich	P7255
GTP	Fermentas	R0461