負染色電子顕微鏡(EM)で視覚化するタンパク質サンプルは、ポピュラーな構造解析の方法となっている。それは、タンパク質製剤の品質の定性試験のためにもそのような研究されている分子の三次元再構成を計算すると、定量的な構造解析に有用である、と。この記事では、EMグリッドを準備する試料を染色し、電子顕微鏡で試料を可視化するための詳細なプロトコールを提示する。初心者ユーザーは、簡単にこれらのプロトコルに従うことができますし、それらのタンパク質サンプルを評価するため、他の生化学的アッセイに加えて、ルーチン分析としてEMを染色陰性活用する。
否定的なステンドグラスや凍結水和生体試料の両方の単粒子の電子顕微鏡(EM)は、構造生物学1の多目的なツールとなっています。近年では、この方法はタンパク質と高分子複合体2、3の構造の研究に大きな成功を収めています。凍結水和蛋白質のサンプルは硝子氷4の薄層に埋め込 まれている電子低温顕微鏡法(cryoEM)、、ネガティブ染色と比較してタンパク質サンプルを高めるために乾燥重金属塩の薄層に埋め込 まれている単純なサンプル調製法です試料のコントラスト5。ネガティブ染色EMの拡張されたコントラストは、比較的小さな生物学的サンプルの検査が可能になります。タンパク質やタンパク質複合体6を精製の3次元(3D)構造を決定することに加えて、この方法ははるかに広い目的のために使用することができます。例えば、負のEMが容易に精製された視覚化するために使用することができる染色タンパク質サンプル、そのような同質性/サンプルの不均一性、蛋白質の複合体または大規模なアセンブリの形成、または単にタンパク質調製物の品質を評価するなどの情報を取得する。
このビデオの記事では、我々は120kVの加速電圧で動作する電子顕微鏡でネガティブ染色サンプルの画像を取得するためにEMを染色陰性のための炭素コーティングされたグリッドを準備するから、ネガティブ染色タンパク質試料を観察するためにEMを使用するための完全なプロトコルを提示する。これらのプロトコルは、日常的に我々の研究室で使用されており、簡単に初心者ユーザを続けることができます。
ネガティブ染色EMは、このようなランダムな円錐形の傾斜と同じ領域から試料から一60℃に傾けたといずれかで画像のペアを収集する必要がある8形式のメソッドを、使用して、精製タンパク質サンプルの立体構造を、研究するために使用できる強力なツールです。しかし、高分子複合体の3次元再構成を計算するために、untilted。さらに、ネガティブ染色EMは異なるコンフォメーション10で、または単に均質性および/ またはそのためのタンパク質サンプルを精製の 不均一性を可視化するためのタンパク質複合体を可視化する、そのような膜タンパク質9の2次元(2D)の結晶のためのスクリーニングなど、他の多くのアプリケーションを、持つことができますタンパク質精製の手順を改善するためにフィードバックを提供する、などこれは、生化学者のための強力なアッセイすることができます。この記事では、我々は電子顕微鏡でネガティブ染色タンパク質サンプルの画像を収集するためにカーボンコートしたグリッドを準備するに至るまでのプロトコルを発表した。ここに示すように、手順はかなり簡単に従うことが容易です。ランダムな円錐形の傾斜法で観察されているサンプルの3D再構成を計算しようとする場合、それは傾斜ペア画像を取得する必要があります。しかし、単粒子解析を行うことが目的であれば、複数のuntiltedの画像で十分です。どちらの場合で、さらに画像処理が必要となり、これはこのビデオの記事の範囲を超えています。
任意のメソッドと同様に、プロトコルのバリエーションがあります。ウラニルギは、ほとんどの場合否定的な染色試薬として非常にうまく機能します。酢酸ウラニルは別の、一般的に使用される負の染色試薬です。それは、しかしより大きな粒径と、多くの場合、ウラニルのギより低いコントラストで、ウラニルギとして非常に似た働きをします。酢酸ウラニルを使用する利点は、ソリューションがウラニルギより長く続くということです。一つは、一人一人または二週間新鮮な溶液を調製する必要はありません。ウラニルギと酢酸の両方が酸性である。明白な懸念は低pHは、研究されているタンパク質サンプルの変化を誘発することができます。両方の染色ソリューションはまた、タンパク質の固定剤として機能する。以前の研究では、両方の修正タンパク質サンプルを迅速7が示されている。この急速な固定は、低pHが重要になります。染色の過程で、タンパク質試料は、低pHがどんな変化を誘導する前に固定になります。それにもかかわらず、このようなモリブデン酸アンモニウムとリンタングステン酸などの他の負染色試薬は、低いpHが懸念7のときのサンプルを染色するためのより良い結果をもたらす可能性があります。モリブデン酸アンモニウムとリンタングステン酸の両方がほぼ中性のpHを有するが、これらの汚れによって生成されたタンパク質サンプルのコントラストは、通常ウラニルギに劣っている。
The authors have nothing to disclose.
鄭研究室で電子顕微鏡の作業は、部分的にNIH(1R01GM082893、1R01GM098672、1S10RR026814 – 01とP50GM082250(A.フランケルまで))、および画期的な医学研究、機会の賞と新技術賞のUCSFのプログラムからの助成金からの補助金によってサポートされています。
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Collodion | Electron Microscopy Sciences, PA, USA | 12620-30 | 30ml, 2% in Amyl Acetate |
Gilder Cu grids | Ted Pella Inc., USA | G400/G200 | 400/200 mesh |
Cressington 208C High Vaccume Turbo Carbon Coater | Ted Pella Inc., USA | 9260 | |
Double pointed Carbon rod | Ted Pella Inc., USA | 58 | |
Uranyl formate | Electron Microscopy Sciences, PA, USA | 16984-59-1 | 99.9% purity |
PELCO easiGlow GlowDischarge system | Ted Pella Inc., USA | 91000 | Purchase at local pharmacy |
Whatman #1 Filter paper | Fisher Scientific | 09-805E |