ネガティブステインEMによるタンパク質と高分子複合体の可視化：グリッドの準備から画像取り込みに

Summary

負染色電子顕微鏡（EM）で視覚化するタンパク質サンプルは、ポピュラーな構造解析の方法となっている。それは、タンパク質製剤の品質の定性試験のためにもそのような研究されている分子の三次元再構成を計算すると、定量的な構造解析に有用である、と。この記事では、EMグリッドを準備する試料を染色し、電子顕微鏡で試料を可視化するための詳細なプロトコールを提示する。初心者ユーザーは、簡単にこれらのプロトコルに従うことができますし、それらのタンパク質サンプルを評価するため、他の生化学的アッセイに加えて、ルーチン分析としてEMを染色陰性活用する。

Abstract

否定的なステンドグラスや凍結水和生体試料の両方の単粒子の電子顕微鏡（EM）は、構造生物学¹の多目的なツールとなっています。近年では、この方法はタンパク質と高分子複合体^2、3の構造の研究に大きな成功を収めています。凍結水和蛋白質のサンプルは硝子氷⁴の薄層に埋め込 ​​まれている電子低温顕微鏡法（cryoEM）、、ネガティブ染色と比較してタンパク質サンプルを高めるために乾燥重金属塩の薄層に埋め込 ​​まれている単純なサンプル調製法です試料のコントラスト^5。ネガティブ染色EMの拡張されたコントラストは、比較的小さな生物学的サンプルの検査が可能になります。タンパク質やタンパク質複合体^6を精製の​​3次元（3D）構造を決定することに加えて、この方法ははるかに広い目的のために使用することができます。例えば、負のEMが容易に精製された視覚化するために使用することができる染色タンパク質サンプル、そのような同質性/サンプルの不均一性、蛋白質の複合体または大規模なアセンブリの形成、または単にタンパク質調製物の品質を評価するなどの情報を取得する。

このビデオの記事では、我々は120kVの加速電圧で動作する電子顕微鏡でネガティブ染色サンプルの画像を取得するためにEMを染色陰性のための炭素コーティングされたグリッドを準備するから、ネガティブ染色タンパク質試料を観察するためにEMを使用するための完全なプロトコルを提示する。これらのプロトコルは、日常的に我々の研究室で使用されており、簡単に初心者ユーザを続けることができます。

Protocol

1。カーボンコーティングのためのEMグリッドの準備蒸留水で大きなガラスのビーカーを埋める。 水の表面にコロジオン（〜20μlの、酢酸アミルの2％、電子顕微鏡学、PA、米国）の一滴を削除するには、ガラスピペットを使用してください。コロジオンは水/空気の表面に薄いプラスチックの層を形成するために分散します。注：コロジオンの最初のドロップは、ほこりの粒子から水面をクリアするために使用されることがあります。最初のドロップからのフィルムの除去後、水の表面はほこりのは明らかです。 光沢のある最密充填パターンで私達は通常50を配置〜100グリッド、、グリッド、水面に浮かぶプラスチック層の上にいずれかのテッドペラ社（アメリカ）、いずれかから購入した400または200メッシュギルダー銅グリッドEMを配置プラスチック層（図1A）に下向きにし、グリッドの側。注：400メッシュグリッドがルーチン負染色EMグリッドに対して優れている、200メッシュのグリッドでは、傾斜ペアの画像を収集するための優れているのに対し。 おせっかいを焼くグリッドはプラスチック層上に配置されている面積よりわずかに大きい寸法を有する紙のCE。グリッド（図1B）の上に慎重に紙を置き、紙が（図1C）完全にウェットになるまで待ちます。注：異なる種類の用紙が異なる吸水率を持っている。紙があまりにも速く水を吸収しないことが重要です。それは速すぎて水を吸収し、しわの多くを行うため、例えば、定期的なフィルターペーパーは、この目的のために良くありません。しわの紙から作られた炭素膜は、このようにランダムな円錐形のチルト3D再構築用の傾斜ペアの画像を収集するためによくない平坦ではない、と。一つは、適切なものを見つけるために別々の論文をテストする必要があります。当研究室では、我々は地元の食料品店から購入したメモ帳から紙を使用している。時々新聞の紙も適していることが判明した。別のオプションは、日本語/中国語書道のために使用される相対的な厚さのライスペーパーを使用することです。 急速に周囲にプラスチックフィルム上に切開を行い、に近い浸した紙。直後に、プラスチックフィルムと紙の間に挟まれたグリッドで紙をピックアップする鉗子のペアを使用してください。空気乾燥（図1D）のために上に向けてグリッドを使用してペトリ皿に紙を置き、注意を：それは、紙の空気乾燥させることが重要です。乾燥が速すぎて紙に多くのしわを生成します。 2。カーボンコーティンググリッド我々の研究室で使用されるカーボンコーティングマシンはCressington 208C高真空ターボカーボンコーター（テッドペラ）です。私たちのシステムは、水晶振動子の発振周波数は、その表面上に堆積された膜の質量によって変化するという原理に基づいて、コーティングされた炭素膜の膜厚を測定するCressingtonの膜厚モニターを搭載しています。それはすべての実験室で頻繁に利用できないので、しかし、ここで記述されたプロトコルは、厚さのモニターを必要としません。 カーボンコーティングmの鉛筆削り（テッドペラ）と負荷の炭素棒を使用して、炭素棒を研ぐachine（図2A）。 2本のロッド、鋭い先端とフラットエンドと他の高いものがお互いに配置されます。 スライドガラスのフロスト面積の半分に真空グリースを塗り、グリッド（図2B）の隣に置きます。スライドガラスのフロスト面積の半分だけが真空グリースで覆われるべきである。注：真空グリースを持つ領域は、カーボンコーティング後の色は変更されません。真空グリースがある場合とない場合の隣接するエリア間のコントラストは、コーティングされたカーボンの厚さの推定を提供します。 カーボンコーティングマシンのステージ上のグリッドに紙を置きます。グリッド（図2C）の隣にガラススライドを置きます。注：一つは、ガラススライドにプラスチックフィルムで被覆された最初の転送のグリッドは、コーティングする前に、ケースには多くのグリッドが紙から落ちることができる。 真空チャンバーをポンプ、真空は10 -5 Torrのレベルに達するまで待ちます。注：低真空でコーティングがしばしばで、多くの大規模なカーボン粒子に、その結​​果、多くの火花を発生させるグリッド。 非常にゆっくり電流を増加させる。カーボンロッドの鋭い先端は、最初の電流が増加するなど、白が赤となるでしょう。 直接肉眼で高輝度の先端を見てください 。コー​​ティングの起動時に電流の増加を停止します。スライドガラスは、灰色として濃い灰色に光を白から色を変更します。スライドの闇は、被覆された炭素膜の厚さを相関させる。所望の厚さが達成された時にコーティングを停止するには、現在の機能をオフにする（図2D）。注：1）繰り返される炭素のコーティングプロセスの後、ガラスのベルジャーの内側からコーティングされた炭素を暗く、その色できた。これは、コーティングされた炭素膜は、それが実際よりも太く表示されるようになります。 2）1つのシャープカーボンロッドは、いくつかのコーティングに使用することができます。先端の鋭さは、徐々に各コーティングの後に削減されます。最大電流は、炭素棒のシャープネスに影響されます。小さい直径を持つ新鮮な尖った棒は低い相対が必要です。炭素を蒸発させるために、現在の。後でコーティングは若干高い電流が必要な場合があります。 真空チャンバーを大気開放し、後で使用するためにコーティングされたグリッドを削除します。 注1。カーボンの厚さを制御するのより正確な方法は、膜厚モニターを使用することです。または1つの質的にモニターで測定された正確な厚さに対して色を調整することができます。このテクニックのための有用な炭素の厚さは3〜7 nmである。 これは通常、炭素コーティングされたグリッド、〜準備あたり100グリッドの大規模な量を準備する簡便な方法です。グリッドは、通常、ネガティブ染色画像の品質に影響しない薄いプラスチックの層を、含まれています。しかし、この方法で調製されたグリッドはcryoEMには適していません。プラスチックのこの層は、数時間のためにクロロホルムにグ​​リッドを浸すことによって除去することができます。 3。 EMを染色陰性のためのウラニルのギ酸塩溶液（0.75％）の準備。詳細なプロトコルであった以前に5を説明し小さなビーカーにウラニルギの37.5mgを秤量。 沸騰した水5 mlを加え、暗所で5分間攪拌する。 10μlの5MのNaOHを追加、5分間攪拌を続行。 シリンジフィルター（Fisherbrand、13ミリメートルシリンジフィルター、0.2μmの、ナイロン、非滅菌、カタログ番号09-720-5）を使用してソリューションをフィルタリングし、アルミ箔で覆われた8ミリリットルファルコンチューブにろ液を保存する。 （注）。ウラニルギ粉末を電子顕微鏡学（ハットフィールド、ペンシルバニア州）、カタログ番号22451から購入することができます。ウラニルのギ酸塩溶液は光に敏感であり、アルミ箔でファルコンチューブを覆うことにより、例えば、直射光から維持する必要があります。新たに調製した溶液は淡黄色色（図3A）があります。それが沈殿開始する前に染色液を1週間から2週間ベンチ上に保存することができます。ウラニルギは、pH〜4と酸性です。 NaOHを追加すると、pHが増加しますが、急激に追加または過剰に沈殿物への汚れを引き起こす可能性があります。コントラストを生成するだけでなく、ウラニルのギは、タンパク質サンプルを修正しています。固定率は非常に急速であるため、低pHは、通常、全体的なタンパク質のコンフォメーションまたはタンパク質複合体形成7を影響しません。 4。負染色EMグリッドを調製するためのプロトコル。このプロトコルは、これまで5で詳しく説明され PELCO easiGlow GlowDischargeシステム（テッドペラ社、米国）を使用してグロー放電の炭素コーティングされたグリッド、。使用される電流は15mAとグリッドです30秒。 注記のために放電グローです。グロー放電グリッドは、グローの放電後すぐに使用する必要があります。私たちはしばしば、グロー放電の後2時間以内にグリッドを使用してください。 場所を蒸留水で220μlの滴とパラフィルムの一部でウラニルのギ酸塩溶液の二つ25μlの滴（図3B）。 車で逆力抗キャピラリー鉗子を使用してグロー放電グリッドを保​​持するボンでコーティングされた面を上向きに。注：これは、抗キャピラリー鉗子を使用する必要がある。そうでない場合は、液体試料は鉗子との間の毛管力によって離れてグリッドから吸い込まれる。 グロー放電グリッドに2μlのタンパク質試料を塗布し、30秒待つ。注：待ち時間とグロー放電の長さがグリッドに吸着した蛋白質の濃度に影響を与える。非常に希釈した試料では、より長い吸着時間が必要です。しかし、長引く吸着は、水の蒸気からの緩衝液濃度を変更することができます。グリッド内の適切な粒度分布を実現するためには多少試行錯誤のアプローチが必要です。 ろ紙を使用してサンプルをオフに汚点。 水滴にグリッドの表面をタッチし、ろ紙で水をオフに汚点。水の2番目のドロップで繰り返します。 汚れ簡単にの最初のドロップにグリッドの表面に触れます。ろ紙で染色液をオフに汚点。 20秒間染色の番目のドロップにグリッドの表面に触れます。ブロットOろ紙とffの染色液。 真空を使用してグリッドを乾かします。注：一つもベンチ上や空気乾燥の化学フードでグリッドを残すことができます。真空乾燥の利点は1つがすぐにEMでグリッドを観察できることです。速乾性に生成される可能性のあるアーティファクトは、染色ムラです。 5。透過型電子顕微鏡このデモで使用されている顕微鏡はガタン4K X 4K CCDカメラを搭載したTecnai T12（FEI社）です。 簡潔にサンプルを挿入する前に、顕微鏡のアライメントをチェックしてください。注：これは、EMセッションごとに一度必要とされる。モデルの顕微鏡では、近くのアライメントは、以前に保存することができます。このようなアライメントファイルをロードすると、近くの状態に顕微鏡の配置を復元する必要があります。 単一のチルト標準試料ホルダにEMグリッドをロードします。 T12のCompuStageにホルダーを挿入します。完了するまでポンピングサイクルを待ちます。 列にホルダーを挿入します。</ LI> 試料をフォーカスし、必要なデフォーカス、通常- 1.5umを設定します。注：フォーカシングは手動で最小コントラスト法を使用してフォーカスやライブ映像をキャプチャし、ライブのフーリエパワースペクトルを計算するためにCCDカメラを使用するか達成することができます。 CCDカメラを使用して画像を記録する。 ネガティブ染色タンパク質サンプルの画像では、タンパク質はしばしば白のコントラスト、暗い背景に白文字密度と見られている。同じグリッドのさまざまな分野でのタンパク質の濃度は通常、非常に類似している間、1つは同じグリッドのさまざまな分野で汚れの異なるレベルを観察することに注意してください。いくつかの他の地域では完璧には汚れているのに対し、時々の分野では、不均一な染色あるいは陽性染色を（蛋白質は、明るい背景に暗い表示される）可能性があります。それは、しばしばイメージングのための良いエリアを見つけるためにグリッドを検索する必要があります。 6。代表的な結果マイナスのSTAの典型的な良いイメージの例inedサンプル、馬脾臓フェリチン（図4A）、ファブ（図4B）、プロテアソーム（図4C）とヌクレオソーム（図4D）古細菌の20Sは、示されている。 図1。 EMを染色陰性のための炭素コーティングされたグリッドの準備。）EMグリッドコロジオン膜の表面上に閉じたパッキングパターンで一つずつ配置する。 B）グリッドの面積より少し大きめの紙を置く。紙が完全に濡れるまでC）待ちます。 D）空気乾燥のためのグリッドと一緒に紙をピックアップ。 図2。 。ポイントの先端に尖ったoneロッド（左）と、塗工装置で行われる二つの炭素棒： カーボンでコーティングEMグリッド ） は、炭素の蒸発器をセットアップします。他のロッドは、（右上）平らな面を持ち、反対の内の1つの点の先端と接触IDE。 B）育んでスライドガラスの片面に真空グリースの少量を置きます。黒い枠内の領域は真空グリースを持っています。 C）コーティング用のグリッドを設定します。ガラスのスライドは、位置に用紙を保持するために使用されます。矢印は、真空グリースで領域を指します。 D）コーティングした後、対象となる真空グリースとスライドの色は、色を変更しません。コントラストは、コーティングされたカーボンの厚さを示している。 図3。ネガティブ染色の手順を示す。）新たに調製した（左）ウラニルのギ酸塩溶液は、沈殿物の符号なしに透過的です。 1〜2週間後、チューブの底の底に蓄積を開始沈殿。 B）蒸留水とパラフィルムの部分にウラニルのギ酸塩溶液2滴2滴（〜25μlの）を配置します。炭素側でグロー放電炭素でコーティングされたEMグリッドを保​​持するために抗キャピラリーピンセットを使用して、アップ。サンプルのドロップ（〜2μlのは）、グリッドに配置されます。 C）30秒間待機した後、ろ紙で解決策を汚点。 D）水の最初のドロップでグリッドのサンプルの面には手を触れないようにグリッドを反転します。染色のプロセスを完了するには、ステップCとDを繰り返します。 図4。ネガティブ染色タンパク質サンプルのEM画像の例。）馬脾臓フェリチン、B）抗原の結合（ファブ）、Cの断片）プロテアソームとD古細菌の20S）は、ヌクレオソーム。すべての画像は同じ倍率で記録した。スケールバーは20nmのです。

Discussion

ネガティブ染色EMは、このようなランダムな円錐形の傾斜と同じ領域から試料から一60℃に傾けたといずれかで画像のペアを収集する必要がある^8形式のメソッドを、使用して、精製タンパク質サンプルの立体構造を、研究するために使用できる強力なツールです。しかし、高分子複合体の3次元再構成を計算するために、untilted。さらに、ネガティブ染色EMは異なるコンフォメーション¹⁰で、または単に均質性および/ ​​またはそのためのタンパク質サンプルを精製の ​​不均一性を可視化するためのタンパク質複合体を可視化する、そのような膜タンパク質⁹の2次元（2D）の結晶のためのスクリーニングなど、他の多くのアプリケーションを、持つことができますタンパク質精製の手順を改善するためにフィードバックを提供する、などこれは、生化学者のための強力なアッセイすることができます。この記事では、我々は電子顕微鏡でネガティブ染色タンパク質サンプルの画像を収集するためにカーボンコートしたグリッドを準備するに至るまでのプロトコルを発表した。ここに示すように、手順はかなり簡単に従うことが容易です。ランダムな円錐形の傾斜法で観察されているサンプルの3D再構成を計算しようとする場合、それは傾斜ペア画像を取得する必要があります。しかし、単粒子解析を行うことが目的であれば、複数のuntiltedの画像で十分です。どちらの場合で、さらに画像処理が必要となり、これはこのビデオの記事の範囲を超えています。

任意のメソッドと同様に、プロトコルのバリエーションがあります。ウラニルギは、ほとんどの場合否定的な染色試薬として非常にうまく機能します。酢酸ウラニルは別の、一般的に使用される負の染色試薬です。それは、しかしより大きな粒径と、多くの場合、ウラニルのギより低いコントラストで、ウラニルギとして非常に似た働きをします。酢酸ウラニルを使用する利点は、ソリューションがウラニルギより長く続くということです。一つは、一人一人または二週間新鮮な溶液を調製する必要はありません。ウラニルギと酢酸の両方が酸性である。明白な懸念は低pHは、研究されているタンパク質サンプルの変化を誘発することができます。両方の染色ソリューションはまた、タンパク質の固定剤として機能する。以前の研究では、両方の修正タンパク質サンプルを迅速⁷が示されている。この急速な固定は、低pHが重要になります。染色の過程で、タンパク質試料は、低pHがどんな変化を誘導する前に固定になります。それにもかかわらず、このようなモリブデン酸アンモニウムとリンタングステン酸などの他の負染色試薬は、低いpHが懸念⁷のときのサンプルを染色するためのより良い結果をもたらす可能性があります。モリブデン酸アンモニウムとリンタングステン酸の両方がほぼ中性のpHを有するが、これらの汚れによって生成されたタンパク質サンプルのコントラストは、通常ウラニルギに劣っている。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Collodion	Electron Microscopy Sciences, PA, USA	12620-30	30ml, 2% in Amyl Acetate
Gilder Cu grids	Ted Pella Inc., USA	G400/G200	400/200 mesh
Cressington 208C High Vaccume Turbo Carbon Coater	Ted Pella Inc., USA	9260
Double pointed Carbon rod	Ted Pella Inc., USA	58
Uranyl formate	Electron Microscopy Sciences, PA, USA	16984-59-1	99.9% purity
PELCO easiGlow GlowDischarge system	Ted Pella Inc., USA	91000	Purchase at local pharmacy
Whatman #1 Filter paper	Fisher Scientific	09-805E