שיווי משקל ניטור שינויים ב-RNA על ידי מבנה 'Peroxidative' ו 'חמצוני "footprinting רדיקלי הידרוקסיל
Summary
פרוטוקול זה מתאר כיצד לכמת את Mg (II) תלויי היווצרות של RNA מבנה שלישוני על ידי שתי שיטות footprinting רדיקלי הידרוקסיל.
Abstract
מולקולות רנ"א תפקיד חיוני בביולוגיה. בנוסף להעברת המידע הגנטי, RNA יכול להתקפל למבנה שלישוני ייחודי למלא תפקיד ביולוגיים ספציפיים כמו קלסר הרגולטור, או זרז. מידע על היווצרות קשר שלישוני הכרחי להבין את הפונקציה של מולקולות RNA. רדיקלים הידרוקסיל (OH •) הן בדיקות ייחודי של המבנה של חומצות גרעין בשל תגובתיות גבוהה שלהם בגודל קטן. 1 כאשר שימש בדיקה footprinting, רדיקלים הידרוקסיל למפות את פני השטח נגיש ממס של עמוד השדרה phosphodiester של ה-DNA ו-RNA 1 עם 2 קנס כמו רזולוציה נוקלאוטיד בודד. Footprinting רדיקלי הידרוקסיל יכול לשמש כדי לזהות את נוקלאוטידים בתוך משטח מגע מולקולאריים, למשל חלבון-DNA ו-RNA-1 חלבון קומפלקסים. שיווי משקל 3 ו 4 מעברים הקינטית ניתן לקבוע על ידי ביצוע footprinting רדיקלי הידרוקסיל כפונקציה של solutiעל משתנים או זמן, בהתאמה. תכונה מרכזית של footprinting היא כי חשיפה מוגבלת בדיקה (למשל, "יחיד פגע קינטיקה ') תוצאות דגימה אחידה של כל נוקלאוטיד של הפולימר. 5
במאמר זה וידאו, אנו משתמשים תחום P4-P6 של ribozyme Tetrahymena כדי להמחיש הכנה RNA מדגם וקביעת (II) בתיווך איזותרמות Mg מתקפלים. אנו מתארים את השימוש בפרוטוקול footprinting הידרוקסיל ידוע קיצוני הדורש H 2 O 2 (שאנו מכנים זה את פרוטוקול "peroxidative") לבין בעל ערך, אך לא ידוע, חלופה המשתמשת O טבעי מומס 2 (אנחנו קוראים לזה ' חמצוני "פרוטוקול). סקירה כללית של צמצום הנתונים, שינוי נהלים ניתוח מוצג.
Protocol
Discussion
Footprinting רדיקלי הידרוקסיל היא כלי רב ערך כדי להעריך את אזור ממס משטח נגיש של חומצות גרעין. היווצרות איכותי וכמותי של מבנה שלישוני 14 ניתן בעקבות כפונקציה של פרמטרים כגון סוג הריכוז יונים, pH, טמפרטורה, או קיפול חלבונים מחייב שיתוף גורמים. שילוב מרתק של פרוטוקול קדימ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהמכון הלאומי לבריאות RO1-GM085130 ואת הקרן הלאומית למדע MCB0929394. אנו מודים לד"ר שמידט מריון על האירוח שלה עבור ומאפשר לנו הסרט במעבדה שלה.
Materials
| Name | Company | Cat# |
|---|---|---|
| Sodium Cacodylate (Caution! Toxic) | Sigma | C4945-25g |
| EDTA (0.5 M) | Ambion | AM9260G |
| DEPC treated water | Ambion | AM9915G |
| Sodium Acetate (3 M) | Ambion | AM9740 |
| MgCl2 (1 M) | Ambion | AM9530G |
| Urea | Ambion | AM9902 |
| Sodium Citrate | Sigma | W302600 |
| tRNA | Sigma | R-7876 |
| Sodium-L-ascorbate | Sigma | A7631-25g |
| Fe(NH4)2(SO4)2 . 6 H2O | Sigma | F1543-500g |
| RNase T1 | Fermentas | EN0541 |
| Hydrogen Peroxide (30%) | Sigma | 349887 |
References
- Tullius, T. D., Dombroski, B. A. Hydroxyl radical “footprinting”: high-resolution information about DNA-protein contacts and application to lambda repressor and Cro protein. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83, 5469-5473 (1986).
- Celander, D. W., Cech, T. R. Iron(II)-ethylenediaminetetraacetic acid catalyzed cleavage of RNA and DNA oligonucleotides: similar reactivity toward single- and double-stranded forms. Biochemistry. 29, 1355-1361 (1990).
- Celander, D. W., Cech, T. R. Visualizing the higher order folding of a catalytic RNA molecule. Science. 251, 401-407 (1991).
- Sclavi, B., Sullivan, M., Chance, M. R., Brenowitz, M., Woodson, S. A. RNA folding at millisecond intervals by synchrotron hydroxyl radical footprinting. Science. 279, 1940-1943 (1998).
- Tullius, T. D., Dombroski, B. A., Churchill, M., Kam, L. Hydroxyl radical footprinting: a high-resolution method for mapping protein-DNA contacts. Methods. Enzym. 155, 537-558 (1987).
- Milligan, J. F., Groebe, D. R., Witherell, G. W., Uhlenbeck, O. C. Oligoribonucleotide synthesis using T7 RNA polymerase and synthetic DNA templates. Nucleic. Acids. Res. 15, 8783-8798 (1987).
- Schlatterer, J. C., Brenowitz, M. Complementing global measures of RNA folding with local reports of backbone solvent accessibility by time resolved hydroxyl radical footprinting. Methods. 49, 142-147 (2009).
- Sambrook, J., Russell, D. W. . Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , (2001).
- Zaug, A. J., Grosshans, C. A., Cech, T. R. Sequence-specific endoribonuclease activity of the Tetrahymena ribozyme: enhanced cleavage of certain oligonucleotide substrates that form mismatched ribozyme-substrate complexes. Biochemistry. 27, 8924-8931 (1988).
- Knapp, G. Enzymatic approaches to probing of RNA secondary and tertiary structure. Methods. Enzym. 180, 192-212 (1989).
- Slatko, B. E., Albright, L. M. Denaturing gel electrophoresis for sequencing. Curr. Protoc. Mol. Biol. Chapter 7, Unit 7.6-Unit 7.6 (2001).
- Das, R., Laederach, A., Pearlman, S. M., Herschlag, D., Altman, R. B. SAFA: semi-automated footprinting analysis software for high-throughput quantification of nucleic acid footprinting experiments. RNA. 11, 344-354 (2005).
- Simmons, K., Martin, J. S., Shcherbakova, I., Laederach, A. Rapid quantification and analysis of kinetic *OH radical footprinting data using SAFA. Methods. Enzym. 468, 47-66 (2009).
- Uchida, T., He, Q., Ralston, C. Y., Brenowitz, M., Chance, M. R. Linkage of monovalent and divalent ion binding in the folding of the P4-P6 domain of the Tetrahymena ribozyme. Biochemistry. 41, 5799-5806 (2002).
- Cate, J. H., Gooding, A. R., Podell, E., Zhou, K., Golden, B. L., Kundrot, C. E., Cech, T. R., Doudna, J. A. Crystal structure of a group I ribozyme domain: principles of RNA packing. Science. 273, 1678-1685 (1996).
- Petri, V., Brenowitz, M. Quantitative nucleic acids footprinting: thermodynamic and kinetic approaches. Curr. Opin. Biotechnol. 8, 36-44 (1997).
- Takamoto, K., Das, R., He, Q., Doniach, S., Brenowitz, M., Herschlag, D., Chance, M. R. Principles of RNA compaction: insights from the equilibrium folding pathway of the P4-P6 RNA domain in monovalent cations. J. Mol. Biol. 343, 1195-1206 (2004).
- Brenowitz, M., Senear, D. F., Shea, M. A., Ackers, G. K. Quantitative DNase footprint titration: a method for studying protein-DNA interactions. Methods. Enzym. 130, 132-181 (1986).
- Shcherbakova, I., Mitra, S. Hydroxyl-radical footprinting to probe equilibrium changes in RNA tertiary structure. Methods. Enzym. 468, 31-46 (2009).
- Howlett, G. J., Minton, A. P., Rivas, G. Analytical ultracentrifugation for the study of protein association and assembly. Curr. Opinion. Chem. Biol. 10, 430-436 (2006).
- McGinnis, J. L., Duncan, C. D., Weeks, K. M. High-throughput SHAPE and hydroxyl radical analysis of RNA structure and ribonucleoprotein assembly. Methods. Enzym. 468, 67-89 (2009).
- Jonikas, M. A., Radmer, R. J., Laederach, A., Das, R., Pearlman, S., Herschlag, D., Altman, R. B. Coarse-grained modeling of large RNA molecules with knowledge-based potentials and structural filters. RNA. 15, 189-199 (2009).
