वीडियो दर स्कैन Confocal माइक्रोस्कोपी और Microendoscopy

Summary

एक कस्टम वास्तविक समय confocal स्कैनिंग इमेजिंग प्रणाली के पूर्ण निर्माण में वर्णित है. इस प्रणाली है, जो आसानी से वीडियो दर माइक्रोस्कोपी और microendoscopy के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है इमेजिंग geometries और अनुप्रयोगों सुलभ नहीं लागत के एक अंश पर मानक वाणिज्यिक confocal सिस्टम का उपयोग कर के एक सरणी के लिए अनुमति देता है.

Abstract

Confocal microscopy has become an invaluable tool in biology and the biomedical sciences, enabling rapid, high-sensitivity, and high-resolution optical sectioning of complex systems. Confocal microscopy is routinely used, for example, to study specific cellular targets¹, monitor dynamics in living cells^2-4, and visualize the three dimensional evolution of entire organisms^5,6. Extensions of confocal imaging systems, such as confocal microendoscopes, allow for high-resolution imaging in vivo⁷ and are currently being applied to disease imaging and diagnosis in clinical settings^8,9.

Confocal microscopy provides three-dimensional resolution by creating so-called “optical sections” using straightforward geometrical optics. In a standard wide-field microscope, fluorescence generated from a sample is collected by an objective lens and relayed directly to a detector. While acceptable for imaging thin samples, thick samples become blurred by fluorescence generated above and below the objective focal plane. In contrast, confocal microscopy enables virtual, optical sectioning of samples, rejecting out-of-focus light to build high resolution three-dimensional representations of samples.

Confocal microscopes achieve this feat by using a confocal aperture in the detection beam path. The fluorescence collected from a sample by the objective is relayed back through the scanning mirrors and through the primary dichroic mirror, a mirror carefully selected to reflect shorter wavelengths such as the laser excitation beam while passing the longer, Stokes-shifted fluorescence emission. This long-wavelength fluorescence signal is then passed to a pair of lenses on either side of a pinhole that is positioned at a plane exactly conjugate with the focal plane of the objective lens. Photons collected from the focal volume of the object are collimated by the objective lens and are focused by the confocal lenses through the pinhole. Fluorescence generated above or below the focal plane will therefore not be collimated properly, and will not pass through the confocal pinhole¹, creating an optical section in which only light from the microscope focus is visible. (Fig 1). Thus the pinhole effectively acts as a virtual aperture in the focal plane, confining the detected emission to only one limited spatial location.

Modern commercial confocal microscopes offer users fully automated operation, making formerly complex imaging procedures relatively straightforward and accessible. Despite the flexibility and power of these systems, commercial confocal microscopes are not well suited for all confocal imaging tasks, such as many in vivo imaging applications. Without the ability to create customized imaging systems to meet their needs, important experiments can remain out of reach to many scientists.

In this article, we provide a step-by-step method for the complete construction of a custom, video-rate confocal imaging system from basic components. The upright microscope will be constructed using a resonant galvanometric mirror to provide the fast scanning axis, while a standard speed resonant galvanometric mirror will scan the slow axis. To create a precise scanned beam in the objective lens focus, these mirrors will be positioned at the so-called telecentric planes using four relay lenses. Confocal detection will be accomplished using a standard, off-the-shelf photomultiplier tube (PMT), and the images will be captured and displayed using a Matrox framegrabber card and the included software.

Protocol

लेजर तरंग दैर्ध्य, dichroic दर्पण, और ऑप्टिकल फिल्टर की पसंद के विशिष्ट प्रयोग में इस्तेमाल किया जा रहा है रंजक के आधार पर निर्धारित किया जाना चाहिए. उदाहरण के लिए, एक Alexa Fluor 488 के साथ दाग नमूना confocal इमेजिंग सबसे अच्छा एक 488 एनएम लेजर, एक 500 एनएम लंबी पास dichroic दर्पण, और एक 30 एनएम बैंडविड्थ bandpass 515 एनएम पर केंद्रित दर्पण का उपयोग करने के लिए पूरा किया है. इसके विपरीत, लाल रंग Alexa Fluor 647 confocal इमेजिंग के घटकों का एक अलग सेट की आवश्यकता होगी. इस प्रोटोकॉल में खुर्दबीन किसी भी डाई है कि 400 एनएम जोरदार अवशोषित और 450 एनएम से परे उत्सर्जन करता है कल्पना करने के लिए बनाया गया था. इसलिए हम एक 406 एनएम उत्तेजना लेजर चुना और 425 एनएम लंबे पास dichroic लेजर बीम को प्रतिबिंबित करने के लिए. उत्साहित fluorophores चुनिंदा उचित उत्सर्जन फिल्टर का चयन करके कल्पना की जा सकती है. यह महत्वपूर्ण है प्रोटोकॉल भर में उचित ऑप्टिकल बढ़ते हार्डवेयर का उपयोग करें जहां संकेत, अनुचित या अस्थायी हार्डवेयर संरेखण के रूप में अच्छी तरह से नहीं पकड़ और एक सुरक्षा के लिए खतरा हो सकता है. <पी वर्ग = "jove_title"> 1. गुंजयमान galvanometric दर्पण और रिले प्रकाशिकी की स्थापना Confocal स्कैनिंग प्रणाली के किसी भी तरह के निर्माण में एक महत्वपूर्ण अवधारणा telecentricity है. एक telecentric ऑप्टिकल प्रणाली में, लेंस एक दूसरे से अपने नाभीय लंबाई, जैसे कि प्रणाली की बढ़ाई बस फोकल 1 लंबाई के अनुपात से परिभाषित किया गया है की राशि से स्थान दिया गया है. यह एक ऑप्टिकल रिले प्रणाली है जहां magnifications, और इस तरह सिस्टम गुण, आसानी से लेंस की पसंद के द्वारा परिभाषित कर रहे हैं के निर्माण में सक्षम बनाता है. एक अन्य महत्वपूर्ण अवधारणा तथाकथित "स्थिर" ऑप्टिकल विमानों, "एपर्चर विमानों" के रूप में भी कहा जाता है शामिल है. एक एपर्चर विमान ऑप्टिकल मार्ग के किनारे एक स्थिति है जहां प्रकाश बीम पार्श्व आंदोलन के किसी भी प्रकार से गुजरना नहीं करता है. पहली और दूसरी स्कैनिंग दर्पण, और उद्देश्य लेंस के पीछे एपर्चर: इस माइक्रोस्कोप डिजाइन में, वहाँ तीन महत्वपूर्ण एपर्चर विमानों रहे हैं. आदेश में प्राप्त करने के लिए इष्टतम बीम scaउद्देश्य के फोकल हवाई जहाज़ पर nning उद्देश्य लेंस के पीछे एपर्चर में प्रवेश बीम स्थिर हो सकता है, कोण में केवल व्यापक चाहिए. आदेश में यह स्थिर, कोण बह विमान बनाने के लिए, हम वापस एपर्चर उद्देश्य के लिए संयुग्म पर पहली और दूसरी स्कैनिंग दर्पण, telecentric विमानों जगह की जरूरत है. दर्पण और उद्देश्य लेंस के बीच रखा लेंस इन स्थिर विमानों (चित्र 2) के बीच बीम कोण स्कैन रिले सेवा करते हैं. स्कैनिंग दर्पण दो स्कैनिंग galvos, जिनमें से प्रत्येक इमेजिंग (एक्स और वाई) विमान के एक दिशा दी स्कैनिंग के लिए जिम्मेदार है पर बढ़ रहे हैं. वीडियो दर इमेजिंग के लिए आवश्यक स्कैन लाइन की दर को प्राप्त करने के एक उच्च आवृत्ति गुंजयमान galvo x-अक्ष (भी "तेजी" अक्ष के रूप में जाना जाता है) स्कैन करने के लिए आवश्यक है. ये galvos एक संवेदनशील, प्रतिक्रिया बंद लूप एक sinusoidal स्कैन पैटर्न बनाने के circuitry के उपयोग और बहुत उच्च आवृत्तियों पर संचालित करने में सक्षम हैं, हम एक 8 kHz galvo चयनित लिए इस का निर्माण. सेट अपमें फाइबर ऑप्टिकल माउंट collimator और मोटे तौर पर किरण समायोजन जैसे कि यह एक सीधी रेखा में यात्रा दोनों क्षैतिज और खड़ी शिकंजा का उपयोग रास्ते पर लाना. अब, एक परितारिका लेने और फाइबर collimator के सामने यह जगह, परितारिका के ऊर्ध्वाधर ऐसी है कि बीम परितारिका केंद्र के माध्यम से सफाई गुजरता ऊंचाई समायोजन. अगला, आईरिस किरण पथ साथ समरेखक से दूर ले जाने और निरीक्षण अगर किरण अभी भी आईरिस केंद्र के माध्यम से यात्रा. यदि नहीं, तो दो समायोजन शिकंजा का उपयोग परितारिका पर किरण की स्थिति को समायोजित. लगभग दर्पण के केंद्र पर तैनात लेजर बीम के साथ किरण पथ में घुड़सवार dichroic दर्पण प्लेस. मेज पर दर्पण clamping से पहले, दर्पण धारक बारी बारी से करने के लिए लगभग 90 डिग्री पर बीम को प्रतिबिंबित और मोटे तौर पर प्रतिबिंब ताकि परिलक्षित लेजर बीम ऊर्ध्वाधर ऊंचाई परिवर्तन नहीं करता है समायोजित. एक लेजर किरण पथ में घुड़सवार गुंजयमान galvanometric दर्पण प्लेस, कार लेनेई सुनिश्चित करने के लिए है कि लेजर बीम दर्पण की सतह के सटीक क्षैतिज केंद्र में तैनात है. इस प्रोटोकॉल में, गुंजयमान galvo दर्पण सीधे एक दर्पण माउंट expoxied था. एक 90 डिग्री के कोण पर लेजर बीम को प्रतिबिंबित दर्पण माउंट घुमाएँ. मोटे तौर पर आईने बंद प्रतिबिंब को समायोजित करने के लिए वही लेजर बीम ऊर्ध्वाधर ऊंचाई को बनाए रखने. आदेश में दिए गए दिशा में प्रकाश की कोई किरण प्रत्यक्ष करने के लिए, एक परिभाषा के द्वारा अंतरिक्ष में दो अंक के माध्यम से जो रे यात्रा करेंगे को परिभाषित करना होगा. यह आमतौर पर वांछित क्षैतिज और ऊर्ध्वाधर मार्ग के किनारे दो irises रखने और लेजर बीम जोड़ तोड़ करने के लिए प्रत्येक परितारिका के केंद्र के माध्यम से पारित करने के द्वारा पूरा किया है. स्वतंत्रता के चार डिग्री के बीम को समायोजित करने की आवश्यकता है, प्रत्येक परितारिका के लिए स्वतंत्रता के दो क्षैतिज और ऊर्ध्वाधर डिग्री. आजादी के इन डिग्री प्राप्त करने का सबसे आम है और सीधा तरीका दो दर्पण चलाने, या "चलना," एक लेज़र बीम का उपयोग करने के लिए है. दो irises ले लो, और उनके ऊर्ध्वाधर ऊंचाई सेट के रूप में1.1 कदम में, लेजर बीम का उपयोग बंद गुंजयमान galvo दर्पण एक संदर्भ के रूप में परिलक्षित. अब, आंख के लिए एक गाइड के रूप में ऑप्टिकल breadboard पर पेंच छेद का उपयोग, दो irises नीचे एक सीधी रेखा में दबाना. Dichroic दर्पण और गुंजयमान galvo दर्पण के लिए लेजर बीम दो irises के केंद्र के माध्यम से चलाने को समायोजित करें. केंद्र के लिए रास्ते में पहले दर्पण (dichroic दर्पण) का प्रयोग पहली परितारिका पर बीम, तो दूसरा परितारिका पर केंद्र किरण पथ में दूसरी दर्पण (गुंजयमान galvo दर्पण) का उपयोग करें. Iteratively इन दो दर्पण समायोजित जब तक बीम दोनों irises के माध्यम से गठबंधन किया है, भर सुनिश्चित करना है कि लेजर बीम गुंजयमान galvo आईने से परिलक्षित अभी भी लगभग दर्पण केंद्र से परिलक्षित होता है. अगर किरण भटक गया है, फाइबर समरेखक माउंट समायोजित और ऊपर चलने का कदम दोहराने. दोनों irises पर केंद्रित बीम के साथ, अब हम दो रिले लेंस है कि हमारी पहली स्थिर, telecentric योजना की छवि जगह होगी(यानी, गुंजयमान galvo दर्पण) ई हमारी दूसरी स्थिर, telecentric विमान पर (यानी, मानक गति galvo दर्पण). इस विशेष खुर्दबीन के लिए, पहली रिले में चयनित लेंस एक ही फोकल लम्बाई, "च" है, तो हमारे telecentric प्रणाली में दो दर्पण के बीच की दूरी है बस 4f. सुनिश्चित करें कि लेंस ठीक किरण पथ में केंद्रित कर रहे हैं, लेंस संरेखण चाल का उपयोग करें. किरण पथ में पहली लेंस प्लेस और लेंस निम्नलिखित किरण पथ में अगले परितारिका पर लेजर बीम स्थान पर देखो. अगला, लेंस ऊंचाई समायोजित खड़ी इतना है कि बीम के ऊर्ध्वाधर केंद्र परितारिका केंद्र में है. अंत में, परितारिका पर केंद्र बीम क्षैतिज बीम की स्थिति को समायोजित. कैर्री बाहर दूसरे लेंस के लिए यह एक ही प्रक्रिया. 2. दूसरी स्कैनिंग दर्पण स्थापना और माइक्रोस्कोप घूर्णन दूसरा telecentric विमान की सही स्थिति का पता करने के लिए, गुंजयमान galvo हुकअपनी इकाई स्कैनिंग और यह मोड़ पर. एक सफेद व्यापार कार्ड का उपयोग करने के लिए दो लेंस के माध्यम से स्कैनिंग बीम ट्रैक. आप गुंजयमान galvo, जहां लेजर बीम पूरी तरह से स्थिर दिखाई देगा से 4f की अनुमानित दूरी पर telecentric विमान मिल जाएगा. मार्क breadboard पर इस स्थिति. इस सटीक telecentric विमान स्थान पर मानक स्कैनिंग galvo दर्पण स्थिति, और दर्पण ऊंचाई और स्थिति ऐसी है कि telecentric विमान में बीम स्कैनिंग दर्पण के सटीक केंद्र हमलों को समायोजित. यह दर्पण नियंत्रण हार्डवेयर शक्ति और स्कैनिंग दर्पण इनपुट पर 0 वोल्ट का एक वोल्टेज डाल इतना है कि इस प्रक्रिया के दौरान तटस्थ स्थिति के लिए दर्पण सुलझेगी के लिए महत्वपूर्ण है. ध्यान दर्पण कोण समायोजित करने के लिए बीम प्रत्यक्ष खड़ी है, और धीरे स्थिति में दर्पण को कस. जैसा कि हम एक ईमानदार माइक्रोस्कोप का निर्माण कर रहे हैं, अब हम एक 90 डिग्री के कोण पर 90 डिग्री बढ़ते कोष्ठक का उपयोग दूसरा breadboard देते हैं जाएगा. बंद करने के लिए सुनिश्चित करेंलेजर और स्कैनिंग इलेक्ट्रॉनिक्स, फाइबर काटना, और इस प्रक्रिया के दौरान स्कैनिंग दर्पण काट. आसान संरेखण के बाकी बनाने के लिए, एक बार कोष्ठक में जगह bolted रहे हैं, ध्यान से पूरे खुर्दबीन ताकि नए breadboard अब फ्लैट झूठ बोल रही है बारी बारी से. काम की सतह breadboard ठीक एक क्लैंप का प्रयोग करें. अब पूर्व ऊर्ध्वाधर सेटअप के शेष फ्लैट breadboard पर आसानी से किया जा सकता है बाहर ले. 3. स्कैन, ट्यूब, और उद्देश्य लेंस की स्थापना अगला हम रिले लेंस, "स्कैन लेंस" और "ट्यूब लेंस" के रूप में औपचारिक रूप से संदर्भित दूसरे सेट की स्थापना की जाएगी. यह इतनी के रूप में लेंस उद्देश्य ध्यान केंद्रित पर सही बढ़ाई प्राप्त करने के लिए और अंतिम छवि संकल्प का अनुकूलन के सही संयोजन का चयन करने के लिए महत्वपूर्ण है. सबसे पहले, किसी भी उद्देश्य लेंस के अधिकतम संख्यात्मक एपर्चर (एनए) को प्राप्त करने के लिए, लेजर बीम का उद्देश्य पीछे हड़ताली भरना होगावापस एपर्चर पूरी तरह से, उसके बाद ही उद्देश्य लेंस यानी ध्यान केंद्रित बनाने के लिए सक्षम हो जाएगा. उद्देश्य लेंस वापस एपर्चर आकार की एक सीमा है, एक लेंस बढ़ाई अनुपात चुना थोड़ा चयनित उद्देश्य के पीछे एपर्चर उमड़ाना है. दूसरा, आदेश में सही बढ़ाई प्राप्त करने के लिए, उद्देश्य लेंस ट्यूब लेंस नाभीय लंबाई है जिसके लिए इसे डिजाइन किया गया था के साथ मिलान किया जाना चाहिए. दुर्भाग्य से, अलग खुर्दबीन उद्देश्य निर्माताओं अलग ट्यूब लेंस नाभीय लंबाई का उपयोग करने के लिए चुना है, इसलिए यह महत्वपूर्ण है के लिए विशिष्ट उद्देश्य लेंस कार्यरत के लिए सही ट्यूब लेंस के साथ एक खुर्दबीन के निर्माण. इसके अलावा, Zeiss के रूप में कुछ निर्माताओं, उनके ट्यूब लेंस डिजाइन करने के लिए उनके मिलान उद्देश्य के विशिष्ट रंगीन aberrations, ऐसी है कि एक अनुचित लेंस उद्देश्य ट्यूब जोड़ी का उपयोग वास्तव में नए aberrations कि अन्यथा मौजूद नहीं होगा परिचय के लिए क्षतिपूर्ति. हम आम तौर पर ओलिंप उद्देश्यों पसंद करते हैं, के रूप में सभी रंगीन मुआवजा वीं में किया जाता हैई उद्देश्य ही, लेंस / उद्देश्य ट्यूब बनाने के आसान बाँधना. हालांकि खुर्दबीन अभी भी काम करेंगे अगर उद्देश्य और ट्यूब लेंस मेल नहीं खाते, वास्तविक खुर्दबीन बढ़ाई संभावना उद्देश्य लेंस पर सूचीबद्ध बढ़ाई मैच नहीं होगा. इस विशेष खुर्दबीन निर्माण के लिए, इष्टतम वापस एपर्चर आकार 4 मिमी, स्कैन लेंस और लेंस ट्यूब के बीच 01:04 बढ़ाई अनुपात की आवश्यकता के लिए निर्धारित किया गया था. के लिए इस कस्टम खुर्दबीन निर्माण, हम 75 मिमी स्कैन लेंस लंबाई और 300 मिमी की एक ट्यूब लेंस लंबाई का उपयोग करेगा. दूसरा स्कैन दर्पण और उद्देश्य ध्यान केंद्रित के बीच कुल दूरी के रूप में बड़ा है, माइक्रोस्कोप के इस खंड का निर्माण पहली लेआउट उद्देश्य लेंस बीम बधिया करने के लिए की जरूरत दर्पण. पहले बड़े 2 "(50 मिमी) व्यास breadboard के किनारे के पास दर्पण, प्लेस और दर्पण माउंट बारी बारी से करने के लिए लेजर बीम लगभग 90 डिग्री को प्रतिबिंबित. मोटे तौर पर आईने बंद प्रतिबिंब को समायोजित करने के लिए एक ही खड़ी BEA के बनाए रखने केमीटर की ऊंचाई. अन्य 2 एक अभिविन्यास है कि एक 90 डिग्री के कोण पर बीम नीचे निर्देशन में breadboard के विपरीत किनारे पर "दर्पण रखें. समायोजन शिकंजा का उपयोग करने के लिए सुनिश्चित करें किरण खड़ी ऊंचाई परिवर्तन नहीं करता है. दो irises सेट, 1.4 चरण में के रूप में, और दो के रूप में 1.5 चरण में केन्द्र बीम irises पर निर्देशित दर्पण समायोजित. अभी भी जगह में irises के साथ, किरण पथ में स्कैन लेंस जगह और केंद्र के अपने क्षैतिज और ऊर्ध्वाधर स्थिति को समायोजित पहली परितारिका पर लेजर हाजिर. से कम 75 मिमी की दूरी + लेंस (दो दर्पण के बीच) से 300 मिमी, ध्यान से बड़े 2 "ट्यूब लेंस की जगह और बीम केंद्र पहली परितारिका पर अपने क्षैतिज और ऊर्ध्वाधर स्थिति को समायोजित. भविष्य में संरेखण बनाए रखने के प्रयोजनों के लिए, यह जगह में इन irises को छोड़ करने के लिए उपयोगी है, इस आवेदन के लिए एक उचित आकार के छेद के साथ एक व्यापार कार्ड एक स्टैंड के लिए सरेस से जोड़ा हुआ हो सकता है और किरण पथ में डाला. सभी दर्पण और लेंस के साथअब जगह में, गुंजयमान galvo दर्पण और मानक स्कैनिंग दर्पण स्कैनिंग शुरू. इस निर्माण में मानक स्कैनिंग दर्पण अंततः एक कस्टम निर्मित जैसे कि चित्रा 3 में वर्णित नियंत्रण परिपथ के माध्यम से गुंजयमान दर्पण के स्कैन की दर से synced किया जाएगा, यह बेहतर ऊर्ध्वाधर और क्षैतिज तुल्यकालन प्रदान करता है. हालांकि, संरेखण उद्देश्यों और कई इमेजिंग अनुप्रयोगों के लिए, दर्पण आसानी से एक समारोह जनरेटर से एक sawtooth पैटर्न का उपयोग कर स्कैन किया जा सकता है. एक व्यापार कार्ड का उपयोग करना, एक स्थिति 300 मिमी पर ट्यूब लेंस के बाद लेजर बीम का पता लगाने. हालांकि किरण कहीं दोनों ऊर्ध्वाधर और क्षैतिज दिशाओं में खुर्दबीन स्कैनिंग है, बीम पूरी तरह से इस स्थान के पास स्थिर होना चाहिए. यह वह जगह है जहाँ उद्देश्य लेंस के पीछे एपर्चर रखा जाएगा. यदि क्षैतिज और ऊर्ध्वाधर स्थिर विमानों किरण पथ के साथ एक ही विमान में मेल नहीं है, ध्यान से unclamp और अनुवाद ट्यूब लेंस ऑप्टिकल मार्ग के किनारे है कि यह सुनिश्चित करने के लिएदोनों विमानों के रूप में संभव के रूप में के रूप में बारीकी से ओवरलैप. पुन केंद्र ट्यूब लेंस के ऊर्ध्वाधर और क्षैतिज स्थिति और स्थिति में सुरक्षित दबाना. किरण पथ में उद्देश्य लेंस प्लेस, सुनिश्चित करने के उद्देश्य लेंस एपर्चर स्थिति के रूप में संभव के रूप में स्थिर विमान के करीब. सच उद्देश्य वापस एपर्चर वास्तव में नहीं होना हमेशा अलग निर्माता डिजाइन विकल्प की वजह से उद्देश्य की शारीरिक वापस खोलने पर स्थित हो सकता है. इसलिए यह हमेशा सर्वश्रेष्ठ निर्माता के साथ जांच करने के लिए सच वापस एपर्चर स्थिति निर्धारित है. नमूना मंच सेट, यकीन है कि अनुवाद माउंट है कि z-अक्ष गति के लिए अनुमति देगा अपनी पूरी रेंज पर उद्देश्य लेंस माउंट में चल रहे बिना स्थानांतरित कर सकते हैं. 4. स्थापना और confocal pinhole और डिटेक्टर aligning सभी बिजली की आपूर्ति और फाइबर ऑप्टिक्स डिस्कनेक्ट, और माइक्रोस्कोप विधानसभा ऐसी है कि इसे फिर से reso पकड़े breadboard पर टिकी हुई है बारी बारी सेNANT स्कैनिंग दर्पण. Breadboard जगह में सुरक्षित दबाना, तो collimator के लिए फाइबर फिर से कनेक्ट करते हैं, और फिर कनेक्ट दोनों galvos और उनके नियंत्रण केबल. पहले की तरह, जगह नियंत्रण वोल्टेज 0 वोल्ट मानक स्कैनिंग galvo चला. नमूना मंच पर, एक व्यापार कार्ड या उद्देश्य ध्यान में एक उज्ज्वल डाई की एक छोटी मात्रा, दो coverslips के बीच sandwiched जगह है. डाई की पसंद लेजर और dichroic चयनित पर निर्भर करेगा, इस मामले में हम एक सफेद व्यापार कार्ड से प्रतिदीप्ति उत्सर्जन का उपयोग करने के लिए confocal पहचान प्रणाली पंक्ति में होगा. क्वांटम डॉट्स भी संरेखण प्रयोजनों के लिए उपयोगी किया जा सकता है, के रूप में वे उज्ज्वल है और photobleach नहीं. अन्य विकल्प फ्लोरोसेंट माला और / या कपड़े के नमूने रंग / कपड़े धोने brightener उजागर करने के लिए, जो दोनों के चमकते प्रतिदीप्ति शामिल हैं. लेजर स्रोत पर मुड़ें और अनुवाद चरण का उपयोग कर खुर्दबीन ध्यान केंद्रित में नमूना लाने. ध्यान में एक बार, नमूना से उत्पन्न प्रतिदीप्ति टी के पीछे दिखाई जानी चाहिएवह dichroic दर्पण के रूप में अगले कदम में वर्णित है. लेजर के रूप में संभव के रूप में उज्ज्वल प्रतिदीप्ति बनाने की शक्ति को अधिकतम. एक व्यापार कार्ड का उपयोग करना, उद्देश्य लेंस और वापस स्कैनिंग प्रणाली के माध्यम से dichroic दर्पण के माध्यम से नमूना से प्रतिदीप्ति उत्सर्जन का पता लगाने. dichroic दर्पण प्रतिदीप्ति उत्सर्जन संचारित जबकि लेजर बीम को दर्शाती है, dichroic दर्पण के दूसरे पक्ष पर इस प्रतिदीप्ति संकेत मिल. अब, dichroic दर्पण के पीछे एक दर्पण जगह है और यह उपयोग करने के लिए एक 90 डिग्री के कोण पर उत्सर्जन को प्रतिबिंबित. एक परितारिका ले लो, के रूप में 1.1 चरण में किया गया था, और इसका इस्तेमाल के साथ आईने के साथ सीधे और संभव के रूप में breadboard के समानांतर प्रतिदीप्ति बीम के रूप में प्रत्यक्ष. इस कदम का सबसे अच्छा मंद प्रकाश में किया जा सकता है बाहर किया जाता है. Confocal pinhole इकाई के रूप में चित्र 2 में वर्णित सेट. हमने पाया है कि स्थानिक फिल्टर से पिंजरे माउंट विधानसभा Thorlabs इस कार्य के लिए आदर्श है. यह महत्वपूर्ण है के लिए एक उपयुक्त pinhol का चयनई आकार कि confocal प्रणाली बहुत अधिक संकेत त्याग के बिना अपने इष्टतम संकल्प तक पहुँच सुनिश्चित करने के लिए. इस कस्टम खुर्दबीन के लिए, 100 सुक्ष्ममापी की एक pinhole आकार चुना गया था. प्रतिदीप्ति किरण पथ के साथ लाइन में स्थानिक फिल्टर यूनिट प्लेस, केंद्र देखभाल प्रतिदीप्ति उत्सर्जन बीम पर ध्यान केंद्रित लेंस माउंट पहली लेने. इकाई (एक खुर्दबीन उद्देश्य भी इस्तेमाल किया जा सकता है) में एक छोटे फोकल लम्बाई लेंस के बढ़ते के बाद, माउंट z-अनुवाद स्लाइड जब तक एक स्पष्ट ध्यान केंद्रित pinhole सतह पर देखा जा सकता है है. सुनिश्चित करें कि पूरी यूनिट प्रतिदीप्ति बीम द्वारा सेट सटीक सीधे लाइन के साथ उन्मुख है. Breadboard के लिए यूनिट दबाना. ज्यादातर नमूनों से उत्सर्जन भी अंधेरे कमरे में परिवेश प्रकाश स्तर की तुलना में कमजोर है. इसलिए यह महत्वपूर्ण है कि पर्याप्त परिरक्षण / प्रकाश उत्सर्जन पथ के साथ चौंकाने वाला इस्तेमाल किया जा आवारा प्रकाश संक्रमण से बचाने के है. इसके अलावा, उच्च परिवेश प्रकाश स्तर अधिभार और नुकसान कई PMTs, कोई ग के साथ विशेष रूप से उनurrent संरक्षण. पाठकों इसलिए कर रहे हैं दृढ़ता से लेंस ट्यूबों का उपयोग करने के लिए उत्सर्जन किरण पथ परिबद्ध का आग्रह किया, यहाँ का प्रदर्शन एक तरह अच्छी तरह से परिरक्षित प्रणाली, कोई आवारा प्रकाश संदूषण के लिए कमरे के प्रकाश में थोड़ा के साथ आपरेशन करने में सक्षम है. अब, अनुवाद मंच पर समायोजन knobs का उपयोग, व्यवस्थित confocal pinhole स्थानांतरित करने के लिए बिंदु जहां pinhole है के माध्यम प्रतिदीप्ति संकेत maximized है. इस स्थिति का सबसे आसानी से दो अक्षों के समायोजन के चलने का pinhole माउंट सतह पर एक 2d खोज प्रदर्शन के माध्यम से की पहचान की है. एक बार संकेत अधिकतम स्थिति में पाया गया है, पिंजरे माउंट पर pinhole बाद collimating लेंस की जगह. प्रतिदीप्ति उत्सर्जन है कि एक व्यापार कार्ड का उपयोग कर confocal इकाई के माध्यम से चला जाता है का पता लगाएं, और पदों के साथ collimating लेंस स्लाइड जब तक उत्सर्जित प्रतिदीप्ति संकेत के रूप में संभव के रूप में collimated है. एक बार बीम collimated है, किरण पथ में एक लेंस टब में उपयुक्त फिल्टर जगह सुनिश्चित होई. फोटोमल्टिप्लायर ट्यूब (PMT) विधानसभा सेट. प्रतिदीप्ति उत्सर्जन किरण पथ में 50 मिमी नाभीय लंबाई लेंस प्लेस और अपने फोकल बिंदु को खोजने के एक व्यापार कार्ड का उपयोग. मार्क breadboard पर इस स्थिति. अब, बंद लेजर पूरी तरह से बारी – यह महत्वपूर्ण है, आवारा या unattenuated लेसर प्रकाश के रूप में स्थायी रूप से सबसे PMTs नुकसान कर सकते हैं. PMT स्थिति इतनी है कि अपनी सक्रिय क्षेत्र के रूप में संभव के रूप में चिह्नित केन्द्र बिन्दु के करीब स्थित है. ध्यान केंद्रित समायोज्य लेंस ट्यूब का उपयोग कर लेंस PMT विधानसभा कनेक्ट है, और ध्यान से सभी उजागर किरण पथ के आसपास pinhole निम्नलिखित अंधेरे टेप लपेटो. लेजर पर मुड़ें, लेकिन इसकी बेहद कम शक्ति ऐसी है कि प्रतिदीप्ति उत्सर्जन मुश्किल से दिखाई है रखना सुनिश्चित करें. PMT पर मुड़ें, सावधानी से एक आस्टसीलस्कप पर वोल्टेज पढ़ने के रूप में नियंत्रण वोल्टेज बढ़ जाती है. PMT इलेक्ट्रॉन गुणा चरणों की एक श्रृंखला के माध्यम से संकेत उत्पन्न, अगर photocurrent घटना प्रकाश स्तर के लिए बहुत अधिक है, ट्यूब जा सकता हैवर्तमान सीमित circuitry के साथ अचल क्षतिग्रस्त. PMTs इसलिए अत्यधिक उपयोगकर्ताओं को, जो ऐसे डिटेक्टरों के साथ पहले काम नहीं किया है के लिए विशेष रूप से सिफारिश की है,. PMT नियंत्रण वोल्टेज बढ़ाएँ जब तक एक readout कील की तरह और / या एक डीसी ऑफसेट आस्टसीलस्कप स्क्रीन पर देखा जा सकता है, ज्यादातर PMTs के लिए, इस भूमि पर नकारात्मक संकेत रिश्तेदार हो जाएगा. पुष्टि करें कि वास्तव में यह संकेत लेजर बिजली बंद करने के लिए संकेत के नुकसान का निरीक्षण कर प्रतिदीप्ति से उठता है. अंत में, iteratively आस्टसीलस्कप पर अधिकतम संकेत के लिए पहली बार ध्यान केंद्रित लेंस स्थिति z-जोड़ तोड़, और तब yz अनुवाद चरण समायोजन द्वारा pinhole संरेखित. माइक्रोस्कोप वीडियो – दर हार्डवेयर पूरा हो गया है! अब दर्पण, कस्टम नियंत्रण बोर्ड, और कंप्यूटर के रूप में छवि में 3 diagrammed हुक. ऊपर के रूप में, यह इमेजिंग प्रणाली का उपयोग करने के लिए पहली बार एक ज्ञात आकार के मानक से कल्पना करने के लिए माइक्रोस्कोप के इष्टतम समाधान खोजने के लिए और पिक्सेल गणना की सिफारिश की हैसंकल्प इमेजिंग प्रणाली के लिए निरंतर. वहाँ कई आकार जैसे प्रसिद्ध पत्र के आकार, प्रतिदीप्ति या चिंतनशील वायु सेना के लक्ष्यों, और फ्लोरोसेंट microspheres के साथ सफेद व्यवसाय कार्ड इस्तेमाल किया जा सकता है कि मानकों, कर रहे हैं. 5. Confocal स्कैनिंग microendoscopy के लिए प्रणाली की तैयारी इस निर्माण हम एक सुसंगत छवि फाइबर, जो फाइबर कोर के कई हजारों की एक बंडल के होते हैं का उपयोग करें, इस तरह की व्यवस्था एक छवि फाइबर और आसानी से खंगाला और / या दूसरे छोर (चित्र 4) में विस्तार के माध्यम से प्रेषित करने की अनुमति देता है. सुसंगत फाइबर इस endoscope की निर्माण में प्रयुक्त बंडल दोनों सिरों पर पॉलिश है, यह एक तथाकथित "संपर्क मोड" microendoscope बनाने. एक छवि में ध्यान इसलिए केवल जब microendoscope टिप एक वस्तु के साथ निकट संपर्क में लाया जाता है गठन हो जाएगा. इस व्यवस्था छद्म confocal खुर्दबीन स्कैनिंग कार्रवाई एक च पर लेजर केंद्रितएक समय में iber कोर, जबकि confocal pinhole सुनिश्चित करता है कि आसपास के रेशों से कोई बाहर के ध्यान केंद्रित प्रकाश डिटेक्टर के माध्यम से पारित करने की अनुमति दी है. विभिन्न इमेजिंग अनुप्रयोगों के लिए, लेंस के एक सेट के बाहर का टिप पर जोड़ा जा सकता है आगे का सामना करना पड़ प्रतिदीप्ति लंबी दूरी की इमेजिंग के लिए अनुमति देने के. Microoptic लेंस, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से ढाल अपवर्तक सूचकांक लेंस (खीस) को आसानी से इस प्रयोग के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, और बाहर का फाइबर ऑप्टिकल गुणवत्ता glues का उपयोग टिप करने के लिए चिपका किया जा सकता है है. Microendoscopy के लिए इमेजिंग प्रणाली की स्थापना करने के लिए, ध्यान से नमूना मंच पर हटाने और यह एक फाइबर होल्डिंग मंच ( चित्र 5) के साथ बदलें. डाई के एक कमजोर समाधान में फाइबर बंडल की डुबकी एक छोर ताकि प्रतिदीप्ति उत्सर्जन फाइबर कोर के सभी भर में समान रूप से उत्पन्न होता है. स्कैनिंग सिस्टम पर मुड़ें और फाइबर धारक को समायोजित करने के लिए ध्यान में फाइबर बंडल (प्रॉक्सिमल अंत, या खुर्दबीन प्रकाशिकी के पास अंत) के दूसरे छोर लाने. सबसे पहले, अनुवाद समायोजन scr उपयोगकेन्द्र के लिए पूर्व चेतावनी प्रणाली को स्कैन क्षेत्र में फाइबर. अब, प्रॉक्सिमल फाइबर सिरे से प्रतिदीप्ति उत्सर्जन छवि पर देखो, जबकि स्कैनिंग. जब पूरा microendoscope सतह उद्देश्य के फोकल हवाई जहाज़ में है, सभी फाइबर कोर भर प्रतिदीप्ति उत्सर्जन के रूप में संभव के रूप में एक समान हो जाएगा. कोण समायोजन knobs का उपयोग फाइबर चेहरे को समायोजित करने के लिए सभी फाइबर कोर समान रूप से उज्ज्वल बनाने के लिए. इस समायोजन के दौरान, यह संभावना आवश्यक हो से फिर से समायोजित अनुवाद स्थिति फिर से केंद्र स्कैन क्षेत्र में फाइबर. इन समायोजनों के माध्यम से पुनरावृति जब तक पूरे फाइबर टिप ध्यान में सही ढंग से है. Microendoscope का उपयोग करने से पहले, धीरे से बाहर का लेंस सफाई HPLC ग्रेड मेथनॉल के साथ थोड़ा गीला कागज का उपयोग टिप साफ. पहले की तरह, एक ज्ञात आकार मानक का उपयोग को मापने के लिए और microendoscope इमेजिंग प्रणाली के संकल्प की गणना. 6. प्रतिनिधि परिणाम: चित्रा 6 एक खत्म UPR के एक उदाहरण से पता चलता हैight confocal खुर्दबीन स्कैनिंग microendoscopy के लिए कॉन्फ़िगर है. लेजर और उत्सर्जन मुस्कराते हुए आंख के लिए एक गाइड के रूप में तैयार किया गया है. एक फाइबर माउंट microendoscopy आपरेशन के दौरान जगह में छवि फाइबर रखती है. यह फाइबर माउंट एक xy या xyz अनुवाद चरण के साथ एक ईमानदार माइक्रोस्कोप मंच के रूप में उपयोग के लिए आसानी से बदला जा सकता है. Thorlabs भागों PT3 (XYZ अनुवाद) या दो चरणों PT1 (XY अनुवाद) काम अच्छी तरह से इस आवेदन के लिए एक सही कोण Thorlabs AP90 भाग के रूप में वर्ग के साथ साथ खड़ी,. एक framegrabber वीडियो कार्ड की दर आने वाले संकेत से छवियों को उत्पन्न करने के लिए प्रयोग किया जाता है. 7 चित्रा एक प्रतिनिधि परीक्षण एक कम मामले का लिया "मीटर" वीडियो दर खुर्दबीन स्कैनिंग सिस्टम का उपयोग एक सफेद व्यापार कार्ड पर मुद्रित छवि दिखाता है. प्रक्षालित सफेद कागज fluorophores है कि यूवी और नीले प्रकाश से उत्साहित कर रहे हैं, अंधेरे पत्र "मी" के पीछे उज्ज्वल पृष्ठभूमि में जिसके परिणामस्वरूप. एक उत्सर्जन 515 एनएम पर केंद्रित फिल्टर इस फ्लोरोसेंट उत्सर्जन इकट्ठा करने के लिए चुना गया था. एक मीटरinor छवि के विरूपण छवि फ्रेम के पार्श्व किनारों के पास विशेष रूप से मनाया जा सकता. 8kHz gavlo दर्पण के sinusoidal स्कैनिंग पैटर्न, और से यह विरूपण के परिणाम में विस्तार से नीचे चर्चा होगी. चित्रा 1 एक confocal सूक्ष्मदर्शी के सिद्धांत ऑपरेटिंग प्रदर्शन आरेख. उद्देश्य ध्यान से उद्भव किरणों वापस प्रणाली के माध्यम से relayed हैं और confocal pinhole (लाल) के माध्यम से ध्यान केंद्रित किया. या तो (नीला) ऊपर या नीचे (हरा) उद्देश्य ध्यान केंद्रित collimated उद्देश्य से उभरने नहीं, और इसलिए प्रारंभिक किरणों कुशलता confocal pinhole है के माध्यम से प्रेषित नहीं कर रहे हैं. चित्रा 2 बीम स्कैनिंग प्रणाली के माध्यम से सभी प्रकाश पथ दिखा आरेख. विमानों पर स्टेशन के साथ स्कैनिंग दर्पण telecentric बैठोtionary, उद्देश्य वापस एपर्चर विमान. स्थिर विमानों के बीच लेंस के जोड़े स्कैन मुस्कराते हुए रिले करने के लिए कार्य. पहले दो रिले लेंस बराबर नाभीय लंबाई है, एक 1:1 दूरबीन बनाने. फोकल लम्बाई में बराबर होना लेंस की दूसरी जोड़ी, औपचारिक रूप से स्कैन लेंस और लेंस ट्यूब के रूप में जाना जाता है, की जरूरत नहीं है, और अक्सर एक किरण विस्तार के उद्देश्य से वापस एपर्चर overfilled है सुनिश्चित दूरबीन के रूप में सेवा. नमूना से उत्सर्जित लाइट स्कैनिंग प्रणाली के माध्यम से वापस यात्रा और dichroic दर्पण के माध्यम से पारित कर दिया है. एक छोटी ध्यान लेंस confocal pinhole है, जो फिर से एक लेंस के द्वारा collimated है के माध्यम से उत्सर्जन प्रकाश केंद्रित है. एक अंतिम लेंस एक फोटोमल्टिप्लायर ट्यूब पर confocal फ़िल्टर उत्सर्जन केंद्रित है. इस छवि का एक पूर्ण आकार संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें . <img src="/files/ftp_upload/3252/3252fig3b.jpg" aलेफ्टिनेंट = "3b चित्रा" /> चित्रा 3 (क) स्कैनिंग इलेक्ट्रॉनिक्स सेटअप के अवलोकन आरेख. खुर्दबीन के समग्र संदर्भ संकेत और timebase "सिंक" तेजी अक्ष गुंजयमान galvo दर्पण है, जो प्रत्येक स्कैन लाइन के अंत में एक टीटीएल नाड़ी उत्पन्न (यानी, जब galvo स्कैन चक्र पूरा कर लिया है) के टीटीएल उत्पादन है . यह framegrabber कार्ड के लिए एच sync संकेत प्रदान करता है. galvo सिंक उत्पादन भी वि सिंक नियंत्रण बोर्ड, जो संवर्द्धित प्रत्येक एच सिंक पल्स के जवाब में अपने उत्पादन में वोल्टेज बढ़ जाती है के लिए sawtooth तरंग है कि धीमी गति स्कैनिंग अक्ष ड्राइव उत्पन्न करने के लिए जुड़ा हुआ है. एक बार सभी लाइनों स्कैन किया गया है, वी सिंक बोर्ड sawtooth तरंग रीसेट करता है और कि framegrabber वी सिंक्रनाइज़ेशन संकेत के रूप में कार्य करता है एक टीटीएल पल्स उत्पन्न करता है. framegrabber कार्ड के लिए अंतिम photomultiplier ट्यूब (ध्यान दें कि कई PMTs नकारात्मक निर्गम वोल्टेज उत्पन्न से इनपुट अनुरूप संकेत है, करने के लिए अपने सर्किट डिजाइन करने के लिए सुनिश्चित होघ अपने हार्डवेयर के अनुसार चुनते हैं). वीडियो दर छवियों को उत्पन्न और Matrox framegrabber सॉफ्टवेयर में प्रदर्शित कर रहे हैं. (ख) उदाहरण नियंत्रण परिपथ. इस डिजाइन में, प्रत्येक एच सिंक नाड़ी की वोल्टेज "जोडी" / सेशन amp संपूर्न में एकीकृत करने के लिए sawtooth तरंग रैंप उत्पन्न, दालों को समन्वित रूप से टीटीएल काउंटर चरण में गिने जाते हैं. जब लाइनों की वांछित संख्या तक पहुँच गया है (यानी, जब रेखापुंज स्कैन पूरा हो गया है), काउंटर के एक सक्रिय कम नाड़ी, जो Schmitt ट्रिगर संपूर्न के लिए एक रीसेट पल्स उत्पन्न करने के लिए ड्राइव "बाहर ले "उत्पन्न करता है. यह दोनों काउंटर और सेशन amp संपूर्न रीसेट करता है, अगले चक्र के लिए सर्किट की तैयारी. उपयुक्त घटक पसंद इस सर्किट रेखापुंज आकार के एक किस्म के लिए व्यापक रूप से लागू करता है. यह केवल एक कार्यान्वयन है, कई अन्य कार्यान्वयन संभव हो रहे हैं और कुछ निश्चित परिस्थितियों में पसंद किया जा सकता है. इसके अलावा, इस सर्किट Matrox framegrabber कार्ड के साथ प्रयोग के लिए डिज़ाइन किया गया हैहै, जो छवि चरण का पता लगाने और स्वचालित रूप से सही है. यदि सर्किट अन्य framegrabbers के साथ इस्तेमाल किया जा रहा है, चरण सुधार circuitry या सॉफ्टवेयर सकता है. आवश्यकता हो सकती है इस छवि का एक पूर्ण आकार संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें. चित्रा 4. एक सुसंगत फाइबर बंडल के माध्यम से छवि संचरण. इस योजना में, बंडल के दोनों तरफ लेंस दोनों फाइबर बंडल के रूप में अच्छी तरह से इनपुट के रूप में फाइबर बंडल उत्पादन पर छवि का विस्तार पर अनुमानित छवि पैमाने जगह में हैं. 5 चित्रा एक फाइबर एक 5 – अक्ष माउंट में रखा बंडल के उदाहरण. एक छोटी सी 1 "व्यास एल्यूमीनियम ब्लॉक ऊब गया था ताकि छवि फाइबर बंडल डाला जा सकता है. फाइबर बीओटी पर एल्यूमीनियम ब्लॉक के अंदर epoxied थाज ऊपर और स्थिरता के लिए नीचे ब्लॉक के. चित्रा 6 पूरा संलग्न microendoscope के साथ माइक्रोस्कोपी प्रणाली की छवि . बेहतर प्रकाश पथ कल्पना करने के लिए, उत्तेजना किरण पथ नीले रंग में तैयार की है, जबकि उत्सर्जन किरण पथ dichroic दर्पण के बाद एक लाल रेखा के रूप में तैयार की है. 7 चित्रा उदाहरण वीडियो दर confocal स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी प्रणाली द्वारा उत्पन्न छवि. एक अंधेरे कम मामले पत्र "मी" एक सफेद व्यापार कार्ड के उज्ज्वल प्रतिदीप्ति पृष्ठभूमि पर प्रकट होता है.

Discussion

इस वीडियो दर इमेजिंग प्रणाली एक गुंजयमान galvanometric दर्पण के संचालन के बारे में 8 kHz पर उपयोग करता है. गूंजनेवाला दर्पण काफी जोर हो सकता है जब पूर्ण सत्ता में संचालित कर सकते हैं, और उनके उच्च पिच कष्टप्रद या भी खतरनाक पर्याप्त जोखिम बार किया जा सकता है. हालांकि यहां से प्रदर्शन नहीं, यह एक पारदर्शी मामले के अंदर गुंजयमान galvanometric दर्पण ढाल प्रणाली मात्रा और / या earplugs जैसे उचित सुनवाई सुरक्षात्मक गियर, पहनने के लिए काफी कम की सिफारिश की है.

गुंजयमान galvanometric दर्पण एक sinusoidal पैटर्न में स्कैन. हालांकि, framegrabber कार्ड संकेत दोनों क्षैतिज और ऊर्ध्वाधर दिशा में एक पूरी तरह से रैखिक झाडू दर संभालने में पढ़ें. चूंकि एक sinusoidal स्वीप स्कैन के किनारों पर धीमा, छवि सम्पीडन कलाकृतियों तेजी से छवि (क्षैतिज) अक्ष के साथ मनाया जा सकता है. एक ही रास्ता के लिए इस समस्या को कम करने के लिए जानबूझकर गुंजयमान galvo दर्पण स्कैनिंग रेंज ड्राइव है, काफी से बड़ारिले लेंस व्यास. ऐसा करने में, केवल लगभग रेखीय sinusoidal स्कैन पैटर्न के केंद्रीय झाडू नमूना पार, छवि विकृतियों को कम करेगा. एक और दृष्टिकोण प्रक्रिया के बाद एकत्र की छवियों को तेजी से धुरी linearize. इस इमेजिंग द्वारा पूरा किया जा सकता है एक ज्ञात फ्लोरोसेंट पैटर्न (जैसे कि एक ग्रिड के रूप में) और ज्ञात पैटर्न आयामों का उपयोग करने के लिए एक प्रसंस्करण स्क्रिप्ट है कि एकत्र की छवियों unwarps बना.

यह विशेष रूप से स्कैनिंग सिस्टम vivo इमेजिंग, जो अक्सर एक ईमानदार उन्मुख वीडियो दर खुर्दबीन की आवश्यकता के प्रयोजन के लिए डिजाइन किया गया था . सेलुलर इमेजिंग प्रयोगों के लिए, उलटा माइक्रोस्कोप अधिक आम तौर पर उपयोग किया जाता है. यहाँ प्रस्तुत डिजाइन आसानी से हो सकता है इस तरह के एक उलटा माइक्रोस्कोप बनाने बदला जा सकता है, सभी आवश्यक है कि अंतिम 2 "व्यास दर्पण के एक रोटेशन है. दर्पण orienting स्कैनिंग बीम के नीचे सीधे के बजाय, दर्पण बीम ऊपर प्रत्यक्ष कर सकते हैं. उद्देश्य लेंस एक रखकरएक नमूना मंच के साथ साथ दर्पण से एक ही दूरी टी इमेजिंग के लिए एक औंधा ज्यामिति में अनुमति होगी. यदि इमेजिंग प्रणाली microendoscopic इमेजिंग के लिए किया जा रहा है पूरी तरह से बनाया, वहाँ कोई कारण माइक्रोस्कोप डिजाइन खड़ी सब पर "गुना" नहीं है. इसके बजाय, संपूर्ण प्रणाली स्कैनिंग उद्देश्य लेंस ऑप्टिकल तालिका करने के लिए उन्मुख समानांतर के साथ एक एकल क्षैतिज breadboard पर बनाया जा सकता है है.

ध्यान दें कि इस निर्माण में खुर्दबीन एक निश्चित pinhole विन्यास का उपयोग करता है, जबकि यह सबसे बड़ी निर्माण सादगी और संरेखण में आसानी के लिए प्रदान करता है, एक और अधिक बहुमुखी प्रणाली इच्छा उपयोगकर्ताओं को एक चर pinhole शामिल करने पर विचार के रूप में सबसे वाणिज्यिक confocal सूक्ष्मदर्शी में पाया जा सकता है है हो सकता है. उपयोगकर्ता उत्सर्जन तीव्रता बदलती के नमूने के लिए क्षतिपूर्ति करने के लिए pinhole के आकार को समायोजित करने के लिए अनुमति करके, इस उपयोगकर्ता किसी दिए गए नमूने के लिए बेहतर करने के लिए सिग्नल की शक्ति और संकल्प के बीच tradeoff अनुकूलन की अनुमति देता है.

चर्चामाइक्रोस्कोप के लिए चयनित छवि फाइबर के oice महत्वपूर्ण है. हम सुमितोमो सुसंगत छवि उनके करीबी फाइबर कोर रिक्ति और कम रिश्तेदार autofluorescence कारण फाइबर का उपयोग करने की सलाह देते हैं. छवि Fujikura द्वारा निर्मित फाइबर autofluorescence ¹⁰ की उच्च मात्रा है, जो एक नमूना से कमजोर प्रतिदीप्ति संकेत डूब और microendoscope के परम संवेदनशीलता को सीमित कर सकते हैं पाया गया है. सुमितोमो जैसे इस विशेष सेटअप में प्रयुक्त 8-30N निर्मित फाइबर, उनके Fujikura समकक्ष की तुलना में बहुत कम autofluorescence स्तर है. जबकि leeched फाइबर बंडलों microendoscopy के लिए आकर्षक माना जा सकता है, उनके डिजाइन आमतौर पर व्यक्तिगत फाइबर कोर बहुत दूर स्थानों, जिसका अर्थ है कि फाइबर कम नमूना वस्तुओं कोर बाहर संभावित हित के महत्वपूर्ण क्षेत्रों को छोड़कर.

अंत में, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि जब खुर्दबीन यहाँ वर्णित की एक किस्म में इन विट्रो में और vivo applicati में उपयोगी हो जाएगा चाहिएons और एक पूर्ण विशेषताओं वाणिज्यिक प्रणाली की लागत के एक अंश के लिए बनाया जा सकता है है, यह संचारित प्रकाश का पता लगाने, देखने के लिए एक ऐपिस या गैर confocal widefield epifluorescence के लिए एक किरण पथ के रूप में सुविधाओं नहीं है. हालांकि यह संभव है खरोंच से इन सुविधाओं के साथ एक प्रणाली का निर्माण करने के लिए, एक ऐसी प्रणाली इच्छा पाठकों के लिए एक मौजूदा वाणिज्यिक उनकी जरूरतों को पूरा करने के बजाय एक पूरी तरह से नए निर्माण आरंभ प्रणाली को संशोधित करने की इच्छा हो सकती है.

Materials

Part Name	Manufacturer	Item Number	Specifications	Quantity
515 nm Band Pass Filter	Chroma	HQ515/50M	46 FWHM	1
Achromatic Doublet Lens 25.4mm Dia. x 50mm FL, MgF2 Coating	Edmund Optics	NT49-766		1
Achromatic Doublet Lens 25.4mm Dia. x 76.2mm FL, MgF2 Coating	Edmund Optics	NT49-768		1
Achromatic Doublet Lens 25.4mm Dia. x 88.9mm FL, MgF2 Coating	Edmund Optics	NT49-769		2
Achromatic Doublet Lens 50mm Dia. x 300mm FL, MgF2 Coating	Edmund Optics	NT45-179		1
8 kHz R High Frequency Optical Scanner	Electro-Optical Products Corporation (EOPC)	SC-30	8 kHz	1
AGC Driver	Electro-Optical Products Corporation (EOPC)	ACG:8K
H7422-PA Photosensor Module	Hamamatsu	H7422-PA	Current limiting recommended	1
M9012 Power Supply	Hamamatsu	M9012	For use with H7422-PA	1
HC PL APO CS Objective	Leica	11506284	10x/0.40	1
Solios eA/XA Framegrabber Card	Matrox	Solios eA/XA	MIL software required; OEM interconnects recommended	1
12V Power Supply	Meanwell	LPV-100-12	+12V, 8.5A	1
5x Microscope Objective Lens	Newport	M-5X	0.10 NA, 25.4 mm Focal Length	1
Coherent Image Fiber	Sumitomo	8-30N		1
1/4″-20 Cap Screw and Hardware Kit	ThorLabs	HW-KIT2		1
100 μm Mounted Pinhole	ThorLabs	P100S	Ideal for building spatial filters	1
30 mm Cage Cube Clamp	ThorLabs	B6C		1
30 mm Cage System Cube, 4-Way	ThorLabs	C4W		1
406 nm, 5 mW, B Pin Code, SM Fiber Pigtailed Laser Diode, FC/PC	ThorLabs	LPS-406-FC	Product obsolete; replaced by LP405-SF10	1
5-Minute Epoxy, 1 Ounce	ThorLabs	G14250		1
6 Axis Kinematic Optic Mount	ThorLabs	K6X		1
8-32 Cap Screw and Hardware Kit	ThorLabs	HW-KIT1		1
8-32 Setscrew and Hardware Kit	ThorLabs	HW-KIT3		1
Adapter with External RMS Threads and Internal SM1 Threads	ThorLabs	SM1A4		1
Adj. FC/PC and FC/APC Collimator, f = 2.0 mm, ARC: 400-600 nm	ThorLabs	CFC-2X-A	f = 2.0 mm	1
Adjustable Fiber Collimator Adapter, SM1 Threaded	ThorLabs	AD9.5F		1
Aluminum Breadboard, 12″ x 18″ x 1/2″	ThorLabs	MB1218	1/4″-20 Threaded	2
Benchtop Laser Diode/TEC Controller	ThorLabs	ITC4001	1 A/96 W	1
DMLP 425 nm Long-Pass Dichroic Mirror	ThorLabs	DMLP425		1
Kinematic Mount for Ø1″ Optics	ThorLabs	KM100		3
LD/TEC Mount for ThorLabs Fiber-Pigtailed Laser Diodes	ThorLabs	LM9LP		1
Lens Mount for Ø18 mm Optics	ThorLabs	LMR18	One retaining ring included	1
Lens Mounts for 2″ Optics	ThorLabs	LMR2S	With internal and external threading; retainer ring included	2
Mini Series Cage Assembly Rod, 6″ Long, Ø4 mm, Qty. 1	ThorLabs	SR6		4
Ø1.0″ Pedestal Pillar Post, 8-32 Taps, 1″ Long	ThorLabs	RS1P8E		4
Ø1″ Pillar Post Extension, Length=0.5	ThorLabs	RS05		4
Ø1″ Pillar Post Extension, Length=0.75″	ThorLabs	RS075		4
Ø1″ Protected Silver Mirror, 3.2 mm Thick	ThorLabs	ME1-P01		1
Ø1″ SM1 Rotating Adjustable Focusing Element, L = 1″	ThorLabs	SM1V10		1
Ø2″ Protected Silver Mirror, 3.2 mm Thick	ThorLabs	ME2-P01		2
P100S – Ø100 μm Mounted Pinhole	ThorLabs	P100S		1
Polaris Low Drift Ø1″ Kinematic Mirror Mount	ThorLabs	POLARIS-K1	Low drift	1
SM1 Lens Tube, L = 1″	ThorLabs	SM1L-10	One retaining ring included	4
SM1 Threaded 30 mm Cage Plate, 0.35″ Thick	ThorLabs	CP02		2
SM1 to M25 Optical Component Threading Adaptor	ThorLabs	SM1A24	External SM1 Threads and Internal M25.5×0.5 Threads	1
Small Beam Diameter Galvo System	ThorLabs	GVSM001		1
Small Clamping Fork	ThorLabs	CF125	1/25″ counterbored slot, universal	15
Spatial Filter System	ThorLabs	KT310	Pinhole sold separately	1
TE-Cooled Mount for 5.6 & 9 mm Lasers	ThorLabs	TCLDM9		1
Vertical Bracket for Breadboards	ThorLabs	VB01	Each	2
Plan-Apochromat	Zeiss	1101-957	20x/0.75 NA	1