ड्रग अतिसंवेदनशीलता में IgE की मध्यस्थता तंत्र की जांच के लिए बेसोफिल सक्रियकरण टेस्ट
Summary
बेसोफिल सक्रियण परीक्षण IgE-निर्भर एलर्जी का पता लगाने के के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है<em> इन विट्रो में</em>. यहाँ बेसोफिल सक्रियण परीक्षण के लिए एक अनुकूलित प्रोटोकॉल के लिए दवा hypersensitivity की जांच करने के लिए प्रयोग किया जाता है. सहसंयोजक दवा प्रोटीन conjugates और उनके भौतिक लक्षण वर्णन के कुशल उत्पादन के लिए एक विधि का वर्णन है.
Abstract
Hypersensitivity reactions against non-steroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs) like propyphenazone (PP) and diclofenac (DF) can manifest as Type I-like allergic reactions 1. In clinical practice, diagnosis of drug hypersensitivity is mainly performed by patient history, as skin testing is not reliable and oral provocation testing bears life-threatening risks for the patient 2. Hence, evidence for an underlying IgE-mediated pathomechanism is hard to obtain.
Here, we present an in vitro method based on the use of human basophils derived from drug-hypersensitive patients that mimics the allergic effector reaction in vivo. As basophils of drug-allergic patients carry IgE molecules specific for the culprit drug, they become activated upon IgE receptor crosslinking and release allergic effector molecules. The activation of basophils can be monitored by the determination of the upregulation of CD63 surface expression using flow cytometry 3.
In the case of low molecular weight drugs, conjugates are designed to enable IgE receptor crosslinking on basophils. As depicted in Figure 1, two representatives of NSAIDs, PP and DF, are covalently bound to human serum albumin (HSA) via a carboxyl group reacting with the primary amino group of lysine residues. DF carries an intrinsic carboxyl group and, thus, can be used directly 4, whereas a carboxyl group-containing derivative of PP had to be organochemically synthesized prior to the study 1.
The coupling degree of the low molecular weight compounds on the protein carrier molecule and their spatial distribution is important to guarantee crosslinking of two IgE receptor molecules. The here described protocol applies high performance-size exclusion chromatography (HPSEC) equipped with a sequential refractive index (RI) and ultra violet (UV) detection system for determination of the coupling degree.
As the described methodology may be applied for other drugs, the basophil activation test (BAT) bears the potential to be used for the determination of IgE-mediated mechanisms in drug hypersensitivity. Here, we determine PP hypersensitivity as IgE-mediated and DF hypersensitivity as non-IgE-mediated by BAT.
Protocol
Discussion
बैट है एक अच्छी तरह से स्थापित हालांकि नहीं अभी तक नियमित रूप से IgE की मध्यस्थता एलर्जी 6,7 रोग के निदान के लिए विधि का इस्तेमाल किया. दवा hypersensitivity के लिए, तथापि, इसके लागू के रूप में कम आणविक भार यौगिकों crosslink IgE रिसेप्टर्स, बेसोफिल 8 सक्रियण के लिए एक शर्त करने में सक्षम नहीं हैं समझौता किया है. इसलिए, जांच के तहत दवाओं covalently उपयुक्त वाहक प्रोटीन (जैसे HSA) करने के लिए युग्मित किया जा जरूरत है. महत्वपूर्ण बात, युग्मन डिग्री (यानी प्रति वाहक प्रोटीन दवा अणुओं की संख्या) conjugates के प्रतिरक्षाविज्ञानी गतिविधि (यानी IgE पार से जोड़ने रिसेप्टर) की गारंटी करने के लिए नियंत्रित किया जा जरूरत है. सिद्धांततः, वाहक अणु प्रति दो haptens IgE रिसेप्टर के लिए पर्याप्त होना चाहिए पार से जोड़ने और के रूप में पांच HSA प्रति लोमो अणुओं के रूप में कुछ के लिए एक सेल आधारित परख में 4 मध्यस्थ रिहाई को ट्रिगर करने के लिए दिखाया गया है. दोनों conjugates, पीपी HSA और DF-HSA, एक पर्याप्त उच्च युग्मन डिग्री (HPSEC) प्रदर्शन और immunologically सक्रिय हो उन्हें बैट में इस्तेमाल के लिए उपयुक्त अभिकर्मकों बनाने के लिए निर्धारित किया गया है. एक और मुद्दा है कि दवा चयापचयों एक भूमिका निभा सकते हो, माता पिता दवा के बजाय एक metabolite के रूप में hypersensitivity प्रतिक्रिया का कारण हो सकता है हो सकता है. लोमो के मामले में, इस संभावना के विस्तार में पहले पांच प्रमुख चरण मैं चयापचयों और एक उठाना 4 संस्करण का उपयोग मूल्यांकन किया गया है. वर्णित तकनीक mastering के लिए महत्वपूर्ण कारकों में रक्त नमूना (<रक्त संग्रह, पता चला basophils की संख्या के बाद से 12 घंटे> 500) और उत्तेजना शर्तों के अनुकूलन (समय, खुराक,) की गुणवत्ता में शामिल हैं. इसके अलावा, गैर responders के जो भी सकारात्मक नियंत्रण (एंटीबॉडी IgE रिसेप्टर के खिलाफ निर्देशित) की पहचान की जा के साथ प्रतिक्रिया नहीं है तथाकथित. इसलिए, मान्यता मानदंड सकारात्मक नियंत्रण के रूप में एक विरोधी FcεRI एंटीबॉडी शामिल है. दवा conjugates का उपयोग करने का एक महत्वपूर्ण लाभ यह तथ्य है कि वे गैर विषैले शुद्ध दवाओं, के रूप में विरोधी FcεRI बैट 4 में एंटीबॉडी के साथ सह उत्तेजना के द्वारा संयुग्म DF-HSA के लिए दिखाया के विपरीत दिखाई है. शुद्ध लोमो, इसके विपरीत में, 1.25 मिलीग्राम / एमएल के एक एकाग्रता में साइटोटोक्सिक प्रभाव को प्रदर्शित करता है विवेचनीयता के 9 बैट के साथ समस्याओं के कारण. आम तौर पर, संभावित cytotoxicity के लिए परीक्षण दृढ़ता से हर नव निर्मित दवा संयुग्म के लिए सिफारिश की है.
यहाँ, हम पीपी-HSA संयुग्म IgE-मध्यस्थता hypersensitivity प्रकट बैट में इस्तेमाल की क्षमता से पता चला है. इसके विपरीत, लोमो hypersensitivity संयुग्म लोमो – HSA के जवाब में बेसोफिल सक्रियण की कमी के द्वारा प्रदर्शन IgE के साथ संबद्ध नहीं है. महत्वपूर्ण बात, एक IgE की मध्यस्थता तंत्र के विषय में अनिश्चितता के मामले में, conjugates प्रतिरक्षाविज्ञानी गतिविधि के लिए इन विट्रो सेल आधारित परख प्रणालियों में मूल्यांकन के रूप में 4 लोमो के लिए दिखाया गया है.
कम आणविक भार दवाओं conjugating उपयुक्त प्रोटीन वाहक covalently वर्णित सेटअप का उपयोग एंटीबायोटिक दवाओं सहित दवाओं, अन्य NSAIDs, radiocontrast मीडिया, मांसपेशियों को ढीला, anesthetics के खिलाफ hypersensitivity प्रतिक्रियाओं के एक नंबर अणु, आदि एक IgE की मध्यस्थता की भागीदारी के लिए जांच की जा सकती है तंत्र. इसलिए, बैट (त्वचा परीक्षण, मौखिक उकसाव परीक्षण) निदान के लिए मौजूदा तरीकों के लिए एक अतिरिक्त के रूप में में सेवा कर सकता है.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम ऑस्ट्रियाई विज्ञान कोष (FWF) अनुदान P18820-B13 द्वारा वित्त पोषित किया गया था.
आचार बयान:
अध्ययन (PLUS_Ethik_090514) Salzburg के विश्वविद्यालय में प्रयोगों से मनुष्य और / या पशु का सहयोग हेलसिंकी Declaraction के साथ पालन के रूप में 1983 में संशोधित और सभी भाग लेने वाले रोगियों को उनके लिखित सूचित सहमति दे दी है के लिए आचार समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था.
Materials
| Name of the reagent/device | Company | Catalogue number | Comments |
|---|---|---|---|
| 2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid | Sigma | M3671 | – |
| 7.8 x 300 mm TSK Gel -G2000SWXL column | Tosoh Bioscience | 08540 | – |
| BD FACSCanto II | Becton Dickinson | 338962 | – |
| Bench top centrifuge | Sigma | – | – |
| Diclofenac sodium salt | Sigma | D6899 | – |
| EDTA-Vacutainer | Becton Dickinson | 368589 | – |
| Flow2 CAST Kit | Bühlmann Laboratories | FK-CCR | Effective June 14, 2011 Flow2 CAST kit is now Flow CAST |
| HP1100 HPLC system | Hewlett Packard | – | – |
| Human Serum Albumin | Sigma | A9511 | – |
| Laboratory centrifuge | Eppendorf | – | – |
| N-Ethyl-N’-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride (EDC) | Sigma | E6383 | – |
| PBS tablets | AppliChem | A9199 | – |
| Propyphenazone derivative | Department of Molecular Biology, University of Salzburg, Austria | – | – |
| Shaker | Eppendorf | – | – |
| Sodium azide | Sigma | S8032 | – |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma | S1679 | – |
| Sodium hydrogen carbonate | Sigma | 90421C | – |
| Sodium hydroxid | Sigma | S5881 | – |
| Sodium phosphate | Sigma | 342483 | – |
| Triple detector array | Viscotek | TDA302 | – |
| Personal BioVortex V-1 plus | Peqlab | 90-V-1 | – |
| Water bath 1012 | GFL | 1012 | – |
References
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