जीनोटाइपिंग पीसीआर आधारित विधि के जंगली प्रकार और सजावटी किस्मों के बीच भेद Imperata cylindrica</em
Summary
हम एक लागत प्रभावी और तेजी से आणविक जीनोटाइपिंग प्रोटोकॉल है कि विविधता विशेष पीसीआर प्राइमरों को रोजगार कि लक्ष्य डीएनए अनुक्रम chloroplast स्पेसर trnL एफ क्षेत्र के भीतर मतभेद की किस्मों के बीच अंतर करने के लिए प्रदान करते हैं<em> Imperata cylindrica</em> (Cogongrass) कि अकेले आकारिकी द्वारा प्रतिष्ठित नहीं कर सकते हैं. इन किस्मों संघ सूचीबद्ध हानिकारक घास, cogongrass और निकट संबंधी व्यापक प्रसार सजावटी किस्म मैं,<em>. cylindrica</em> Var.<em> Koenigii</em> (जापानी रक्त घास).
Abstract
Wild-type I. cylindrica (cogongrass) is one of the top ten worst invasive plants in the world, negatively impacting agricultural and natural resources in 73 different countries throughout Africa, Asia, Europe, New Zealand, Oceania and the Americas1-2. Cogongrass forms rapidly-spreading, monodominant stands that displace a large variety of native plant species and in turn threaten the native animals that depend on the displaced native plant species for forage and shelter. To add to the problem, an ornamental variety [I. cylindrica var. koenigii (Retzius)] is widely marketed under the names of Imperata cylindrica ‘Rubra’, Red Baron, and Japanese blood grass (JBG). This variety is putatively sterile and noninvasive and is considered a desirable ornamental for its red-colored leaves. However, under the correct conditions, JBG can produce viable seed (Carol Holko, 2009 personal communication) and can revert to a green invasive form that is often indistinguishable from cogongrass as it takes on the distinguishing characteristics of the wild-type invasive variety4 (Figure 1). This makes identification using morphology a difficult task even for well-trained plant taxonomists. Reversion of JBG to an aggressive green phenotype is also not a rare occurrence. Using sequence comparisons of coding and variable regions in both nuclear and chloroplast DNA, we have confirmed that JBG has reverted to the green invasive within the states of Maryland, South Carolina, and Missouri. JBG has been sold and planted in just about every state in the continental U.S. where there is not an active cogongrass infestation. The extent of the revert problem in not well understood because reverted plants are undocumented and often destroyed.
Application of this molecular protocol provides a method to identify JBG reverts and can help keep these varieties from co-occurring and possibly hybridizing. Cogongrass is an obligate outcrosser and, when crossed with a different genotype, can produce viable wind-dispersed seeds that spread cogongrass over wide distances5-7. JBG has a slightly different genotype than cogongrass and may be able to form viable hybrids with cogongrass. To add to the problem, JBG is more cold and shade tolerant than cogongrass8-10, and gene flow between these two varieties is likely to generate hybrids that are more aggressive, shade tolerant, and cold hardy than wild-type cogongrass. While wild-type cogongrass currently infests over 490 million hectares worldwide, in the Southeast U.S. it infests over 500,000 hectares and is capable of occupying most of the U.S. as it rapidly spreads northward due to its broad niche and geographic potential3,7,11. The potential of a genetic crossing is a serious concern for the USDA-APHIS Federal Noxious Week Program. Currently, the USDA-APHIS prohibits JBG in states where there are major cogongrass infestations (e.g., Florida, Alabama, Mississippi). However, preventing the two varieties from combining can prove more difficult as cogongrass and JBG expand their distributions. Furthermore, the distribution of the JBG revert is currently unknown and without the ability to identify these varieties through morphology, some cogongrass infestations may be the result of JBG reverts. Unfortunately, current molecular methods of identification typically rely on AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphisms) and DNA sequencing, both of which are time consuming and costly. Here, we present the first cost-effective and reliable PCR-based molecular genotyping method to accurately distinguish between cogongrass and JBG revert.
Protocol
Discussion
अमेरिकी नर्सरी और परिदृश्य उद्योगों की खेती और बिक्री विदेशी और उपन्यास संयंत्र प्रजातियों पर पनपे. यह व्यापार के बढ़ते वैश्वीकरण के साथ मिलकर, संभावना है कि एक आक्रामक प्रजातियों के पौधे में प्रवेश स्थापित होगा, और अमेरिका में फैल करने के लिए संघ जानकारी पर निर्भर करता है कि अक्सर उपलब्ध नहीं है आक्रामक बनने की क्षमता सहित, इस तरह के पौधों को विनियमित करने की क्षमता बढ़ जाती है सही वर्गीकरण, और देशी और देशीयकृत taxa से आनुवंशिक शुद्धता क्योंकि इनवेसिव पौधों के हमारे ज्ञान अक्सर सीमित है, छुपा आक्रामक विशेषताओं के साथ आयातित संयंत्रों को स्वेच्छा से किया गया है केवल बाद में जानने के लिए कि वे हमारे कृषि और प्राकृतिक संसाधनों पर आक्रमण करने के लिए शुरू की है. इस प्रोटोकॉल जैसे कि मैं के साथ जुड़े समस्याओं का समाधान करना पहले सरलीकृत आणविक विधि है कि सही प्रकार के जंगली cogongrass और अपने सजावटी JBG समकक्ष लौट फार्म के बीच भेद कर सकते हैं प्रदान करके cylindrica किस्मों.
इस प्रोटोकॉल के विकास के लिए jove_content ">, जंगली प्रकार cogongrass सांता रोजा के निकट जे, FL काउंटी में 2008 के जून में तालाब क्रीक वानिकी इकाई में देशीयकृत आबादी से एकत्र किया गया था JBG एक वाणिज्यिक नर्सरी (Bluebird नर्सरी, इंक से प्राप्त किया गया था. .) के रूप में अच्छी तरह के रूप में जून 2008 में कोलंबिया में एक homeowner के संग्रह से, एमओ JBG जून 2008 में Clemson विश्वविद्यालय, अनुसूचित जाति पर कैम्पबेल भूवैज्ञानिक संग्रहालय के आंगन से प्राप्त किया गया बदल जाती है, जून 2009 में Riverdale, एमए में विश्वविद्यालय पार्क से, और कोलंबिया, एमओ 2009 में (लेलैंड Cseke द्वारा की पहचान) में एक homeowner के सामने यार्ड से सभी पौधों. Huntsville में अलबामा के विश्वविद्यालय (Huntsville, AL) पर स्थित ग्रीन हाउस में बनाए रखा गया.इन पौधों से एकत्र डीएनए की जेनेटिक अनुक्रमण 9 स्वतंत्र डीएनए सामान्यतः बारकोड 2 पौधों के लिए प्रयोग किया जाता क्षेत्रों की गहराई की तुलना में शामिल हैं. सभी मामलों में, JBG के दृश्यों JBG वापस लौटने के उन लोगों के लिए एक 100% मैच थे, इस प्रकार की मदद करने के लिएसत्यापित करें कि JBG वास्तव में एक हरे रंग की, आक्रामक फार्म वापस करता है. केवल परमाणु इसके chloroplast और trnL एफ क्षेत्रों मतभेद है कि आनुवंशिक रूप से cogongrass और JBG के बीच भेद किया जा सकता है. इसके क्षेत्र के 3 cogongrass और JBG के बीच SNPs के (एकल nucleotide बहुरूपताओं) के एक कुल की है, जबकि क्षेत्र trnL एफ 2 SNPs और 2 InDels (सम्मिलन और हटाना). इन आनुवंशिक मतभेद विविधता विशेष पीसीआर प्राइमरों की अनुमति दी है कि जंगली प्रकार cogongrass और JBG बदल जाती है के बीच भेद कर सकते हैं विकसित किया जा. सबसे विश्वसनीय परिणाम plastid trnL एफ क्षेत्र से व्युत्पन्न प्राइमरों से आ गए. इस प्रकार, इस प्रोटोकॉल की cogongrass, JBG chloroplast जीनोम के trnL एफ क्षेत्रों और JBG (चित्रा 4) लौट के बीच मतभेद अनुक्रम पर आधारित है.
प्राइमरों है कि अधिक प्रश्न में किस्मों के लिए विशिष्ट हैं उत्पन्न करने में मदद करने के लिए और मदद के लिए निकट से संबंधित प्रजातियों, अल से झूठी सकारात्मक से बचने केमैं जाना जाता है, मैं के trnL एफ दृश्यों cylindrica किस्मों संबंधित घास की प्रजातियों (29 प्रजातियों में से 43 स्वतंत्र दृश्यों, जैसे, Cymbopogon citratus, Sorghastrum incompletum, lacryma jobi Coix, miscanthus sinensis, इक्षु, चारा halepense) से trnL एफ दृश्यों के साथ तुलना की गई. हालांकि, हम घास, विविधता विशिष्ट प्राइमरों की विशिष्टता की 29 प्रजातियों भर में विविधता विशिष्ट प्राइमर दृश्यों की जांच की व्यापक नहीं किया गया है सबसे अन्य घास की प्रजातियों से डीएनए बढ़ाना करने की क्षमता के लिए जांच की. नतीजतन, डीएनए निष्कर्षण के लिए इस्तेमाल किया ऊतक ध्यान से मैं के रूप में पहचान किया जाना चाहिए cylindrica इस प्रोटोकॉल से पहले शुरू करने के लिए. यदि घास या तो cogongrass या JBG रूप पहचान नहीं कर सकते हैं तो हम सुझाव है कि पीसीआर उत्पाद अनुक्रमण करने के लिए यकीन है कि के दृश्यों cogongrass या JBG के लिए एक सटीक मैच. वर्तमान में, सबसे सटीक पद्धति दिया घास नमूना की पहचान को सत्यापित करने के लिए दोनों टी पर पीसीआर प्रदर्शनRNL एफ और इसके क्षेत्रों, पीसीआर उत्पादों के अनुक्रम सत्यापन और सही पहचान taxa से जाना जाता है दृश्यों के दृश्यों की तुलना द्वारा पीछा किया. डीएनए नियंत्रण इस प्रोटोकॉल में विस्तृत प्राइमरों (क्षेत्र trnL – एफ के लिए) या अन्य कि 13-15 अन्य प्रकाशनों में उपलब्ध प्राइमरों का उपयोग परिलक्षित किया जा सकता है. अनुक्रमण बहुत अधिक श्रम और हमारे सरलीकृत प्रक्रिया का उपयोग कर से गहन कीमत है.
पीसीआर के लिए इस्तेमाल किया प्राइमरों की गुणवत्ता प्रक्रिया की सफलता के लिए महत्वपूर्ण है. हम इस प्रक्रिया से उपलब्ध तिर्यक जैव इंक (के लिए प्राइमरों बना दिया है http://www.obliquebio.com/web/ , Huntsville, AL). तिर्यक जैव से प्राइमरों आदेश करने के लिए लाभ है कि वे, प्राइमरों हम अनुकूलन के लिए हमारी प्रयोगशाला में प्रयोग किया जाता के रूप में समान नमूना उत्पादन श्रृंखला से प्रत्येक किताब की aliquots की बड़ी संख्या की दुकान. नतीजतन, प्राइमरों उसी क्रम ही नहीं है, लेकिन टीहे सटीक एक ही उत्पादन बहुत है कि इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किया गया था से आ. एक ही बहुत से प्राइमरों का उपयोग करने में मदद कर सकते हैं प्रक्रिया में बाहरी चर है कि पीसीआर प्राइमरों की गुणवत्ता में अंतर से हो सकता है से बचने के. इसी तरह, जबकि अन्य Taq पीसीआर पीसीआर, Taq पोलीमरेज़ का इस्तेमाल किया गुणवत्ता के लिए ठीक काम करना चाहिए पीसीआर परिणाम की गुणवत्ता पर असर पड़ेगा. पीसीआर अभिकर्मकों में बेहतर स्थिरता के लिए अनुमति देने के लिए, हम Clontech से प्रोटोकॉल का उपयोग कर अभिकर्मकों अनुकूलित है. लाभ 2 पोलीमरेज़ (Clontech, माउंटेन व्यू, सीए, 639,201 # ६३९२०२ या बिल्ली) एक मजबूत, गर्म शुरू Taq पोलीमरेज़ का एक मिश्रण है और पढ़ने एक एंजाइम सबूत है कि उच्च विशिष्टता और अधिक सटीक amplifications प्रदान में मदद करता है.
क्योंकि यह प्रोटोकॉल chloroplast डीएनए है, जो माता के रूप में घास में विरासत में मिला है पर निर्भर करता है, cogongrass और JBG जीनोटाइप के बीच संकरण की घटनाओं हमारे आणविक पहचान प्रक्रिया के साथ कब्जा नहीं कर सकता है. मामलों में जहां hypridization suspe हैcted, हम परमाणु क्षेत्रों है कि दोनों के माता पिता से विरासत में मिला रहे हैं का उपयोग करने की सलाह देते हैं. सबसे अधिक इस्तेमाल किया गैर plastid चर लिए संयंत्र जीनोटाइपिंग में विचार क्षेत्र परमाणु ribosomal इसके 13-15,17 क्षेत्र है. वर्तमान में, हम कि परमाणु वही पीसीआर ट्यूब में इसके क्षेत्र के साथ chloroplast क्षेत्र एफ trnL के प्रवर्धन बहुसंकेतन की दिशा में प्रगति कर रहे हैं. परमाणु डीएनए क्षेत्रों के साथ plastid बहुसंकेतन संभवतः या तो अकेले का उपयोग की सीमाओं को दरकिनार होगा, लेकिन, इस तरह के तरीकों अनुकूलन और अतिरिक्त मूल्यांकन की आवश्यकता है के लिए मामले के आधार द्वारा एक मामले पर व्यवहार्यता का निर्धारण. मात्रात्मक वास्तविक समय पीसीआर (qPCR) और आणविक बीकन, (फ्लोरोसेंट प्राइमर जांच) के रूप में नई प्रौद्योगिकियों, का उपयोग भी कर रहे हैं असफल सुरक्षित और सही संयंत्र जीनोटाइपिंग तरीके के रूप में मूल्यांकन किया जा रहा है.
यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल करने के लिए एक तेज और विश्वसनीय भेद JBG जंगली प्रकार cogongrass के उस से वापस लौटने के लिए दृष्टिकोण प्रदान करता है. हम प्रोत्साहित करते हैं का उपयोग करेंइस प्रोटोकॉल की रु हमसे संपर्क करने के लिए इस प्रोटोकॉल के उपयोग से प्राप्त परिणामों की रिपोर्ट. इस तरह के साझा जानकारी में मदद मिलेगी JBG बदल जाती है के वितरण पर जानकारी प्रदान करते हैं. यह भी मदद के USDA में नियामकों कार्यों है कि प्रसार और अत्यधिक आक्रामक cogongrass किस्मों के संभावित संकरण को दरकिनार करने की जरूरत है किया जा सकता है पर सूचित निर्णय करना होगा.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम नमूनों को प्राप्त करने में सहायता के लिए एलन tasker (USDA APHIS, Riverdale, एमडी), स्टीफन कॉम्पटन (Clemson), शेरी Aultman Clemson (), क्रेग रैमसे (USDA APHIS, किले कोलिन्स, CO), और बेटी Marose (UMD) है धन्यवाद . हम वीडियो की शूटिंग में अपने काम के लिए के एंड्रयू एड्रियन (UA Huntsville) और डेरेक ठेकर (UA Huntsville) इस प्रोटोकॉल परीक्षण में उनकी सहायता के लिए, और यूसुफ Herdy के छात्रों को धन्यवाद देता हूं. यह काम राष्ट्रीय मछली और वन्य जीव फाउंडेशन द्वारा वित्त पोषित किया गया था.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| DNeasy Plant Mini Kit | Qiagen, Valencia, CA | 69104 or 69106 | Any reputable genomic plant DNA kit that yields good quality DNA should work fine for these procedures. |
| trnF(GAA)-F | Oblique Bio, Inc. | 3-0578 | Forward positive control primer |
| trnL(5′ exon)-C | Oblique Bio, Inc. | 3-0579 | Reverse positive control primer |
| trnLF-C-F1 | Oblique Bio, Inc. | 3-0864 | Forward wild-type cogongrass primer |
| trnLF-C-R1 | Oblique Bio, Inc. | 3-0865 | Reverse wild-type cogongrass primer |
| trnLF-R-F2 | Oblique Bio, Inc. | 3-0866 | Forward JBG and JBG revert primer |
| trnLF-R-R2 | Oblique Bio, Inc. | 3-0867 | Reverse JBG and JBG revert primer |
| Advantage UltraPure PCR dNTP Mix | Clontech, Mountain View, CA | 639125 | |
| Advantage 2 Polymerase | Clontech, Mountain View, CA | 639201 or 639202 | A good proof-reading, hot-start Taq polymerase |
References
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