En metod för märkning vaskulatur i embryonala möss
Summary
I den här artikeln beskrivs en metod för märkning embryonala hud och tymus blodkärl.
Abstract
Inrättandet av en fungerande blodkärl nätverk är en viktig del av organogenesen, och krävs för optimal organfunktion. Till exempel, i tymus korrekt vaskulaturen bildning och mönstring är nödvändig för tymocyt inträde i organet och mogna T-cell-utgång till periferin. Den rumsliga arrangemanget av blodkärl i tymus är beroende signaler från den lokala mikromiljön, nämligen tymiska epitelceller (TEC). Flera färska rapporter tyder på att störningar av dessa signaler ger tymus blodkärl brister 1,2. Tidigare studier har beskrivit tekniker som används för att märka den neonatala och vuxna bräss vaskulatur 1,2. Vi visar här en teknik för märkning blodkärl i embryonala tymus. Denna metod kombinerar användningen av FITC-dextran eller Griffonia (Bandeiraea) simplicifolia lektin I (GSL 1 – isolectin B 4) ansikts ven injektioner och CD31 antikroppsfärgning att identifiera tymus vascular strukturer och PDGFR-β att märka tymus perivaskulära mesenkym 3-5. Alternativet att använda kryosnitt eller vibratom sektioner tillhandahålls också. Detta protokoll kan användas för att identifiera tymus vaskulära defekter, vilket är avgörande för att definiera roller TEC-härledda molekyler i tymus blodkärlsbildning. Eftersom metoden märker hela kärlsystemet, kan den också användas för att analysera de vaskulära nätverk i flera organ och vävnader i hela embryot inklusive hud och hjärta 6-10.
Protocol
Discussion
Hel-fäste och PECAM-1 (CD31) färgning på sektioner är de konventionella metoderna för märkning av kärlen i embryonala möss. Dessa metoder kräver användning av direkt och / eller indirekt immunofluorescens, och tvättmedel till permeabilisering musvävnad. Det visar sig vara en ganska lägligt process. Här har vi använt FITC-dextran eller isolectin B 4 ansikts injektioner vein att direkt märka embryonala vaskulaturen, vilket eliminerar kravet på steg antikroppsmärkning. Vidare medger denna metod…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av bidrag nummer R01AI055001 och R01AI082127 från NIAID till NRM och SREB Disputation Fellowship Award till JLB.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
|---|---|---|
| FITC-dextran | Sigma | FD150S-1G |
| Fluorescein labeled GSL 1 – isolectin B4 | Vector Laboratories | FL-1201 |
| Fast Green | MP Biomedicals | 195178 |
| PFA | Fluka | 76240 |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11550 |
| Optimal Cutting Temperature Compound (O.C.T. | VWR | 25608-930 |
| Acetone | JT Baker | 9006-33 |
| Donkey Serum | Jackson | 017-000-121 |
| rat anti-mouse CD31, | BD Pharmingen | 558736 |
| goat anti-mouse PDGFR-β | R&D Systems | AF1042 |
| donkey anti-rat CD31 Alexa 647 (Invitrogen) | Biolegend | 102516 |
| donkey anti-goat Alexa 594 (Invitrogen) | Invitrogen | A11058 |
| Triton X -100 | Sigma-Aldrich | X-100 |
| Low melt agarose/PBS | Sigma-Aldrich | A9414-25G |
| Methanol | Fisher Scientific | A413-4 |
| Benzyl Alcohol | Acros Scientific | 148390010 |
| Benzyl Benzoate | Acros Scientific | 105860010 |
| Depression slides | Fisher Scientific | S175201 |
| Fluorogel | Electron Microscopy Sciences | 17985-10 |
| Cover Glass (22X22)-1.5 | Thermo Scientific | 152222 |
| Zeiss LSM 510 Meta Confocal Microscope | Zeiss | |
| Micro dissecting forceps | Roboz | RS-5135 |
| Parafilm No. OM992 | Fisher Scientific | 13-374-16 |
| 12 and 24 well microplates | Evergreen Scientific | 222-8044-01F |
| Superfrost/Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 |
| 4mL clear vials | National Scientific | B7800-2 |
References
- Cuddihy, A. R. VEGF-mediated cross-talk within the neonatal murine thymus. Blood. 113, 2723-2731 (2009).
- Muller, S. M. Gene targeting of VEGF-A in thymus epithelium disrupts thymus blood vessel architecture. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 102, 10587-10592 (2005).
- Muller, S. M. Neural crest origin of perivascular mesenchyme in the adult thymus. J. Immunol. 180, 5344-5351 (2008).
- Foster, K. Contribution of neural crest-derived cells in the embryonic and adult thymus. J. Immunol. 180, 3183-3189 (2008).
- Liu, C. Coordination between CCR7- and CCR9-mediated chemokine signals in prevascular fetal thymus colonization. Blood. 108, 2531-2539 (2006).
- Lavine, K. J. Fibroblast growth factor signals regulate a wave of Hedgehog activation that is essential for coronary vascular development. Genes Dev. 20, 1651-1666 (2006).
- Lavine, K. J., Kovacs, A., Ornitz, D. M. Hedgehog signaling is critical for maintenance of the adult coronary vasculature in mice. J. Clin Invest. 118, 2404-2414 (2008).
- Mukouyama, Y. S., Gerber, H. P., Ferrara, N., Gu, C., Anderson, D. J. Peripheral nerve-derived VEGF promotes arterial differentiation via neuropilin 1-mediated positive feedback. Development. 132, 941-952 (2005).
- Mukouyama, Y. S., Shin, D., Britsch, S., Taniguchi, M., Anderson, D. J. Sensory nerves determine the pattern of arterial differentiation and blood vessel branching in the skin. Cell. 109, 693-705 (2002).
- Murphy, P. A. Endothelial Notch4 signaling induces hallmarks of brain arteriovenous malformations in mice. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105, 10901-10906 (2008).
