RNAi Medierad Gene Knockdown och genmodifiering genom mikroinjektion i Necromenic Nematode Pristionchus pacificus</em
Summary
I modellorganismer kan genmodifiering manipulera genfunktioner medan RNAi kan ÖVERVÄLDIGANDE specifika mRNA transkript 1-2. Detta protokoll syftar till att illustrera de tekniker som behövs för att införa stabilt överförs DNA och övergående dubbelsträngat RNA i necromenic nematoder<em> Pristionchus pacificus</em> För studier i evolutionär, utvecklings-och beteendevetenskaplig biologi.
Abstract
Även om det är allt överkomligt för nya modellorganismer för att få helt sekvenserade genom ytterligare fördjupad geners funktion och analyser uttryck genom RNA-interferens och stabil genmodifiering förblir begränsade i många arter på grund av särskilda anatomi och molekylär cellbiologi av organismen. Till exempel har utanför kronan gruppen Caenorhabditis som inkluderar Caenorhabditis elegans 3, stabilt överförs transgena linjerna i icke-Caenorhabditis arter som inte redovisats i denna bestickande fylum (Nematoda), med undantag för Strongyloides stercoralis 4 och Pristionchus pacificus 5. För att underlätta den växande roll P. pacificus i studien av utveckling, evolution och beteende 6-7, beskriver vi här de nuvarande metoderna att använda mikroinjektion för att göra transgena djur och genen slå ner med RNAi. Liksom gonaderna i <em> C. elegans och de flesta andra nematoder, könskörtlarna av P. pacificus är syncitial och kan integrera DNA och RNA i ägg när de levereras av direkta mikroinjektion. Till skillnad från C. elegans dock stabil transgenen arv och somatiska uttryck i P. pacificus kräver tillsats av själv arvsmassans DNA kokas med endonukleaser komplement till ändarna på mål transgener och markörer coinjection 5. Tillägget av bärare arvsmassans DNA liknar kravet på transgenen uttryck i Strongyloides stercoralis 4 och i könsceller av C. elegans. Det är dock oklart om specifika krav för djurens egna arvsmassans DNA beror på s. pacificus Soma är mycket effektiv att tysta okomplicerade flera exemplar gener eller att extrakromosomala arrayer i P. pacificus kräver genomiska sekvenser för korrekt kinetochor montering under mitosen. Den ventrala migrering av två beväpnade (didelphic) gonaderna hermafroditer ytterligare komplicerar möjligheten att injicera både gonader i enskilda maskar 8. Vi visar också användningen av mikroinjektion att ÖVERVÄLDIGANDE en dominant mutation (rulle, tu92) genom att injicera dubbelsträngat RNA (dsRNA) i könskörtlarna att få icke-rullande F 1 avkomma. Till skillnad från C. elegans, men liksom de flesta andra nematoder, s. pacificus PS312 är inte mottaglig för systemisk RNAi via matning och blötläggning och därför dsRNA måste administreras genom mikroinjektion i syncitial gonaderna. I den här aktuella studien hoppas vi att beskriva mikroinjektion processen som behövs för att förvandla en PPA-EGL-4 promotorn:: GFP fusion reporter och ÖVERVÄLDIGANDE en dominerande roller PRL-1 (tu92) mutant i en visuellt informativa protokoll.
Protocol
Discussion
P. pacificus populationer finns i nära samarbete med olika arter skarabé skalbagge över hela världen och är en modell nematod mellanting mellan fria levande och parasitiska nematoder. Styrkan i P. pacificus som en ny modell organism låg i integrationen av genetiska och fysiska kartor som främjar positionella kartläggning av mutanter isolerade från objektiva framåt genetiska skärmar (dvs. inte bara för kandidatgener tidigare karaktäriserat i C. elegans) 6,10. Me…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna är mycket tacksamma till RJ Sommer och X Wang för hjälp med mikroinjektion, samt kommentarer insiktsfulla från den anonyma granskare. Detta arbete stöds av NIH bidrag SC2GM089602.
Materials
| Product: | Catalog #: | Supplier: |
|---|---|---|
| DMI3000 Injection microscope | DMI3000 | Leica |
| Microinjector manipulator (Direct drive) | Narashige BC-3 Ball joint | Tritech Research |
| Needle Puller | Narashige PC-10 | Tritech Research |
| MicroInjector™ All-Digital Multi-pressure System | Narashige MINJ-D | Tritech Research |
| GeneElute™Mammalian Genomic DNA Miniprep Kit | G1N70 | Sigma |
| pJet Cloning Jet kit | K1231 | Fermentas |
| GeneJET plasmid Miniprep kit | K0502 | Fermentas |
| DNA Clean & Concentrator™ | D4005 | ZYMO Research |
| BLOCK-IT™ RNAi TOPO® transcription kit | K3500-01 & K3650-01 | Invitrogen |
| Difco™Agar Noble | DF0142-15-2 | Fisher Scientifi |
| Microscope cover glass (1.5 – 0.16 to 0.19mm thick; Size: 50 x 45mm) | 12-554-F | Fisher Scientific |
| Glass capillaries (filament) | 615000 | A-M systems |
| Paraffin Oil (Heavy) | O122-1 | Fisher Scientific |
| KH2PO4 | P386-500 | Fisher Scientific |
| Na2HPO4 | AC20651-5000 | Fisher Scientific |
| NaCl | BP3581 | Fisher Scientific |
| MgSO4 | M80-500 | Fisher Scientific |
References
- Fire, A., Xu, S., Montgomery, M. K., Kostas, S. A., Driver, S. E., Mello, C. C. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391, 806-811 (1998).
- Ahringer, J. Reverse Genetics. Wormbook. , (2006).
- Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D., Ambros, V. Efficient gene transfer in C. elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences. EMBO J. 10, 3959-3970 (1991).
- Junio, A. J., Li, X., Massery, H. C., Nolan, T. J., Lamitina, S. T., Sundaram, M. V., Lok, J. B. Strongyloides stercoralis: cell- and tissue-specific transgene expression and co-transformation with vector constructs incorporating a common multifunctional 3′ UTR. Exp. Parasitology. 118, 253-265 (2008).
- Schlager, B., Wang, X., Braach, G., Sommer, R. J. Molecular cloning of a dominant roller mutant and establishment of DNA-mediated transformation in the nematode Pristionchus pacificus. Genesis. 47, 300-304 (2009).
- Hong, R. L., Sommer, R. J. Pristionchus pacificus: a well-rounded nematode. Bioessays. 28, 651-659 (2006).
- Hong, R. L., Sommer, R. J. Chemoattraction in Pristionchus nematodes and implications for insect recognition. Curr. Biol. 16, 2359-2365 (2006).
- Rudel, D., Riebesell, M., Sommer, R. J. Gonadogenesis in Pristionchus pacificus and organ evolution: development, adult morphology and cell-cell interactions in the hermaphrodite gonad. Dev. Biol. 277, 200-221 (2005).
- Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science. 11, 802-805 (1994).
- Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. An Introduction to Worm Lab: from Culturing Worms to Mutagenesis. J. Vis. Exp. (47), e2293-e2293 (2011).
- Evans, T. C. Transformation and Microinjection. Wormbook. , (2006).
