مكتبة معرف الهدف هو البلازميد ومقرها الجينوم على نطاق جمع من [كدنا] المستنسخة يستخدم لتحديد أهداف ميرنا. هنا علينا أن نبرهن كيفية استخدامه وتطبيقه.
تم تصميم المكتبة الرقم المستهدف للمساعدة في اكتشاف وتحديد الأهداف من microRNA (ميرنا). مكتبة معرف الهدف هو البلازميد ومقرها الجينوم على نطاق مكتبة [كدنا] المستنسخة في اتجاه مجرى النهر 3'UTR من انصهار بروتين ثنائي اختيار، ثيميدين كيناز-zeocin (TKzeo). الجولة الأولى من اختيار هو لtransformants مستقرة، تليها مع الأخذ ميرنا من الفائدة، وأخيرا، واختيار لcDNAs تحتوي على هدف وميرنا و. ويتم تحديد cDNAs مختارة من قبل التسلسل (انظر الشكل 1-3 لمعرف الهدف سير العمل المكتبات والمعلومات).
لضمان تغطية واسعة من transcriptome الإنسان، تم إنشاؤها الهدف رقم مكتبة cDNAs عبر بنسبة ضئيلة من DT فتيلة باستخدام مجموعة من الحمض النووي الريبي مجموع المحضرة من أنسجة بشرية متعددة وخطوط الخلية. مما أدى مجموعة [كدنا] 0،5-4 كيلو بايت، مع متوسط حجم 1.2 كيلوبايت، وكانت مستنسخة في البلازميد المزدوج اختيار p3TKzeo (انظر الشكل 4 لخريطة البلازميد). الأهداف الجينات ممثلة في لىويمكن الاطلاع على الموقع الشبكي لbrary سيغما الدريخ. نتائج من التسلسل البورشيد (الجدول 3)، وتبين أن المكتبة تضم 16922 من 21518 جينات فريدة من نوعها في RefGene UCSC (79٪)، أو 14000 الجينات مع 10 أو أكثر يقرأ (66٪).
microRNAs هي 20-24 RNAs والنوكليوتيدات التي تنظم التعبير الجيني في مرحلة ما بعد transcriptionally التي تحول دون ترجمة مرنا، وبشكل متكرر، زعزعة استقرار مرنا المستهدفة (النظر في [6]). ويجوز للميرنا واحدة تنظم عدة مئات من mRNAs للسيطرة على استجابة الخلية لمؤشرات التنموية والبيئية. تحديد والتحقق من صحة mRNAs هدف أساسي في تحديد دور ميرنا وظيفة في هذه المسارات. ومع ذلك، وتحديد الهدف ليست مباشرة، لأنه في الحيوانات، miRNAs والمواقع المستهدفة ليست متكاملة تماما. في "البذور" المنطقة، والقواعد من 2 إلى 7 من نهاية 5'-من ميرنا، عادة ما تكون مكملة لأهدافها. ومع ذلك، هناك العديد من الاستثناءات لقاعدة البذور، والمصب قاعدة الاقتران يمكن أن تعوض عن مباراة البذور ناقص. وقد تم وضع عدد من خوارزميات الكمبيوتر للتنبؤ اهداف ميرنا على أساس مطابقة البذور والتعويض المصب، والبنية الهدف 1د موقف، والحفاظ على تسلسل، وغيرها من المعالم المختلفة التي لوحظت للأهداف التحقق تجريبيا (مراجعة في [7]). بينما في silico التنبؤات هي مريحة وتفعل الكثير من تحديد أهداف ميرنا ساري المفعول، وتوقع معظم الجينات فشل التحقق من صحة الاختبارات التجريبية، وعدم توقع الكثير من الأهداف الفعلية. وعلاوة على ذلك، منذ وتستند خوارزميات الكمبيوتر في ملامح الهدف التي سبق تحديدها، أنها لا تسمح باكتشاف الأهداف التي تحيد عن ما هو معروف بالفعل.
وقد تم استخدام عدد من النظم التجريبية بنجاح لتحديد أو اكتشاف الأهداف ميرنا وظيفية في الخلايا الحية. هذه الأساليب تشمل الفحص العالمية ميكروأرس الحمض النووي الريبي والتسلسل، RNA المشترك مناعي (RIP)، ومستقرة وصفها النظائر مع الأحماض الأمينية في ثقافة خلية (SILAC)، وهي طريقة البروتين (مراجعة في [7]). كل أسلوب له مزاياه وعيوبه. منذ ميرنا تستهدف زعزعة الاستقرار في كثير من الاحيان مرنا ويؤدي الى تدهورها، يا خسارةويمكن البحث في زيادة مستوى مرنا بعد إدخال ميرنا تقليد أو المانع، على التوالي، وتحديد الأهداف ميرنا. تم الكشف بسهولة هذه الخسارة أو الربح من مرنا من قبل ميكروأري أو تسلسل عميق. في حين طرق الكشف مرنا هي أبسط وأكثر حساسية من طرق الكشف البروتين، والكشف عن مرنا يغيب عن أي أهداف ميرنا التي ليست متدهورة. التقارير الأخيرة من مختبر Bartell مقارنة النتائج المستهدفة من الكشف عن الحمض النووي الريبي ميرنا مع هؤلاء من SILAC [8] أو التنميط الريبوسوم [9] إشارة إلى أن miRNAs الثدييات التصرف في الغالب عن طريق خفض مستويات مرنا الهدف. ومع ذلك، فقد اكتشفت مختبرات أخرى كثيرة تعمل مع الأهداف الفردية ميرنا تغير في البروتين ولكن أي تغيير في مستوى مرنا. تقارير ما يبدو أن تنظيم متعدية مع عدم فقدان مرنا للكشف ما يلي: مير 10B في HOXD10 [10]، miR221/222 على p27kip1 [11]، مير-21 على Pdcd4 [12]، مير 126 في p85β [13] مير-34 على SIRT1 [14]، مير-21 على PTEN [15]، مير 302d في Arid4b [16]، مير 200C على JAG1 [17]، 567 مير 299، 297، و، والثانية 609 في VEGFA [18]. وعلاوة على ذلك، كلانسي وآخرون [19] ذكرت مؤخرا ان تم الكشف عن تنظيم متعدية فقط بواسطة Let-7 عندما تم الكشف عن الأشكال الإسوية مرنا الفردية التي تحتوي على موقع دعونا-7 الهدف بشكل انتقائي. هذه الأخيرة تشير إلى أنه، على الأقل في بعض الحالات، يمكن التغاضي عن تنظيم متعدية في لمحة مركب – وهذا هو، عندما يتم الكشف عن جميع الأشكال الإسوية مرنا واحدة مرنا – التي تم الحصول عليها كما هو الحال مع العديد من ميكروأري والتحليلات تسلسل. وسوف يشارك في مناعي من ميرنا، مرنا المجمعات عبر argonaute (ago2 عادة) أو بروتين آخر يرتبط (الحمض النووي الريبي مناعي، أو RIP) عزل أهداف ميرنا بغض النظر عن آلية التنظيم. وبالإضافة إلى ذلك، RIP بالكشف عن الذاتية، ويفترض من الناحية البيولوجية ذات الصلة، وتفاعلات. ومع ذلك، وليس من المعروف ما إذا كانت جميع التفاعلات ميرنا، مرنا وظيفية، وRIP من شأنه أن يفوت أي أهداف مرنا أن أضم عابر فقط أو تتدهور بسرعة. وعلاوة على ذلك، لا بد من استنتاج محدد ميرنا-مرنا شركاء bioinformatiلأن ساتيا جميع أزواج ميرنا-مرنا شارك في عجل معا. أخيرا، SILAC يحدد مباشرة على المنتج النهائي للتنظيم ميرنا، وهو البروتين نفسه، ولكن غير حساس ويفتقد بالتالي البروتينات النادرة والتغييرات أضعاف صغيرة في مستويات البروتين.
في ضوء القيود الحالية مع الأساليب ميرنا تحديد الهدف، وشعرنا بان من الضروري ايجاد فحص إضافي العالمي لتحديد أهداف ميرنا الفنية من خلال آلية بديلة. لتلبية هذه الحاجة، مرخصة لدينا التكنولوجيا التي اخترعها Gaken يوب والعظيم Mohamedali من كينجز كوليدج بلندن. اختراعهم هو التحام اختيار مزدوج البروتين، وعلى وجه التحديد، وكيناز-zeocin ثيميدين الانصهار، والتي تنظمها مكتبة [كدنا] من احتمال تسلسل الهدف ميرنا في 3'UTR لها. ويمكن تحديد خلايا transfected ثابت مع والتعبير عن TKzeo، [كدنا] يبني مع zeocin، كما هو موضح في الشكل رقم 2. بعد تعبر عن ميرنا من مصلحة، يمكن تحديد الأهداف التي ميرنا ووايganciclovir عشر، كما هو موضح في الشكل رقم 3. Ganciclovir يقتل الخلايا معربا عن كيناز ثيميدين، وهذا هو، أي الخلايا معربا عن TKzeo، [كدنا] تفتقر هدفا لميرنا من الفائدة. ويمكن أن تكون معزولة استهدفت [كدنا] من التضخيم PCR من الحمض النووي من الخلايا التي البقاء على قيد الحياة باستخدام ganciclovir الاشعال التي يمكن أن تكون متسلسلة الجناح المنتجات [كدنا]، وPCR لتحديد الأهداف.
لقد قمنا بتطوير تكنولوجيا كلية الملك إلى وسيلة جديدة لتحديد الهوية العالمية، واكتشاف أهداف وظيفية ميرنا الإنسان – معرف الهدف المكتبة البعثة. مع الهدف المكتبة الهوية، ويمكن للمستخدمين عزل أهداف ميرنا من خلال سلسلة من الثدييات خلية ترنسفكأيشن الثقافة وخطوات اختيار الدواء. مكتبة شاملة، ويحتوي على 66-79٪ من الجينات البشرية. النتائج الأولية تشير إلى أن كلا اكتشف سابقا، وكذلك يمكن أن تكون معزولة أهداف جديدة من معرف المكتبة بعثة الهدف.
على الرغم من أن البروتوكول هو من بعض طول،استخدم هدف المكتبة رقم قياسي يتطلب تقنيات مختبر الجزيئية – زراعة الخلايا الثديية، ترنسفكأيشن، واختيار الدواء، PCR، والتسلسل – وبالتالي، ينبغي أن يكون جيدا في وسائل معظم علماء الأحياء. نقترح ان يتم إيلاء الاهتمام الكافي لتصميم التجارب المناسبة، وتحسين ظروف والثقافة، والأهم من ذلك، قبل اختبار كل نوع من الخلايا الجديدة لتحديد مستويات الدواء الأمثل للحصول على خطوات اختيار (قتل، منحنيات) لضمان نجاح مع الهدف المكتبة الهوية.
كما هو الحال مع جميع وسائل ميرنا تحديد الهدف، ومن المستحسن جدا أن يتم التحقق من صحة الأهداف التي تم تحديدها عن طريق فحص مكتبة معرف الهدف مع الأسلوب الثاني، مثل [ميكروأري، qRT PCR، مراسل فحص (أي luciferase المراسل)، أو تحليل الغربية.
The authors have nothing to disclose.
نشكر الحياة سيجما كامل العلم بعثة الهدف رقم مكتبة فريق التطوير، خصوصا كيفن Gutshall من أجل العثور على التكنولوجيا والتفاوض على شروط الترخيص، وHolemon هيذر لتقديم الدعم لها والمشاركة في مناقشات مثمرة استكشاف الأخطاء وإصلاحها. كما نشكر الدكتور يوب Gäken من كينجز كوليدج بلندن لتبادل بحرية النتائج غير المنشورة والاقتراحات، وقاضي حامد RxBiosciences لتحضير وجبات كبيرة من [كدنا]، واصراره في الحصول على أنها مستنسخة. نود أن نعترف نان لين وبحر سكوت من SAFC لتنفيذ المصفوفات [كدنا] وتحليل البيانات.
المهمة هي علامة تجارية مسجلة لشركة التكنولوجيا الحيوية سيغما الدريخ
Name of the reagent | Company | Catalog Number | Comments |
JumpStart REDTaq ReadyMix | Sigma-Aldrich | P0982 | |
Ganciclovir | Sigma-Aldrich | G2536 | |
G418 | Sigma-Aldrich | G8168 | |
Puromycin | Sigma-Aldrich | P9620 | |
Topo TA | Invitrogen | KNM4500-01 | |
GenElute Mammalian Genomic DNA Miniprep Kit | Sigma-Aldrich | G1N10 | |
Cell Specific Nucleofection kit | Lonza | ||
Nucleofector | Lonza | AAD-1001 | |
Zeocin | Invitrogen | R250-01 | |
Target ID Library | Sigma-Aldrich | MREH01 |