Oligodendrocyte संस्कृति समृद्ध और Oligodendrocyte न्यूरॉन / डाक प्रसव murine ऊतकों से सह संस्कृतियों Myelinating की व्युत्पत्ति

Summary

इस अनुच्छेद के प्राथमिक संस्कृति में समृद्ध murine oligodendrocyte अग्रदूत साबित कोशिकाओं (OPCs) की आबादी, जो परिपक्व oligodendrocytes (OLS) उत्पादन अंतर प्राप्त करने के तरीकों का वर्णन करता है. इसके अलावा, इस रिपोर्ट तकनीक का वर्णन करने के लिए उत्पादन murine माउस पृष्ठीय रूट नाड़ीग्रन्थि न्यूरॉन्स (DRGNs) के एक neurite बिस्तर पर माउस OPCs बोने द्वारा सह संस्कृतियों myelinating.

Abstract

Identifying the molecular mechanisms underlying OL development is not only critical to furthering our knowledge of OL biology, but also has implications for understanding the pathogenesis of demyelinating diseases such as Multiple Sclerosis (MS). Cellular development is commonly studied with primary cell culture models. Primary cell culture facilitates the evaluation of a given cell type by providing a controlled environment, free of the extraneous variables that are present in vivo. While OL cultures derived from rats have provided a vast amount of insight into OL biology, similar efforts at establishing OL cultures from mice has been met with major obstacles. Developing methods to culture murine primary OLs is imperative in order to take advantage of the available transgenic mouse lines.

Multiple methods for extraction of OPCs from rodent tissue have been described, ranging from neurosphere derivation, differential adhesion purification and immunopurification ^1-3. While many methods offer success, most require extensive culture times and/or costly equipment/reagents. To circumvent this, purifying OPCs from murine tissue with an adaptation of the method originally described by McCarthy & de Vellis ² is preferred. This method involves physically separating OPCs from a mixed glial culture derived from neonatal rodent cortices. The result is a purified OPC population that can be differentiated into an OL-enriched culture. This approach is appealing due to its relatively short culture time and the unnecessary requirement for growth factors or immunopanning antibodies.

While exploring the mechanisms of OL development in a purified culture is informative, it does not provide the most physiologically relevant environment for assessing myelin sheath formation. Co-culturing OLs with neurons would lend insight into the molecular underpinnings regulating OL-mediated myelination of axons. For many OL/neuron co-culture studies, dorsal root ganglion neurons (DRGNs) have proven to be the neuron type of choice. They are ideal for co-culture with OLs due to their ease of extraction, minimal amount of contaminating cells, and formation of dense neurite beds. While studies using rat/mouse myelinating xenocultures have been published ^4-6, a method for the derivation of such OL/DRGN myelinating co-cultures from post-natal murine tissue has not been described. Here we present detailed methods on how to effectively produce such cultures, along with examples of expected results. These methods are useful for addressing questions relevant to OL development/myelinating function, and are useful tools in the field of neuroscience.

Protocol

आचार विवरण इस काम में इस्तेमाल चूहों कैनेडियन परिषद (CCAC) जानवर की देखभाल पर दिशा निर्देशों के अनुसार करने के लिए परवाह थे. किए गए प्रयोगों के लिए नैतिक अनुमोदन प्रोटोकॉल संख्या OGH 119 के तहत ओटावा जानवर की देखभाल समिति के विश्वविद्यालय से प्राप्त हुई थी. 1. विच्छेदन – OPC निकासी के लिए नवजात माउस प्रांतस्था संस्थागत दिशा निर्देशों के अनुसार P0-P2 माउस बलिदान. मस्तिष्क और ठंडा सदस्य (एंटीबायोटिक मुक्त) से युक्त एक पेट्री डिश में जगह काटना. एक विच्छेदन खुर्दबीन पकवान स्थानांतरण. मस्तिष्क पृष्ठीय पक्ष के साथ एक स्केलपेल का उपयोग, एक उथले चीरा sagittally प्रत्येक प्रांतस्था (चित्र 1a) का सबसे औसत दर्जे का बढ़त के साथ. यह चीरा केवल meningeal परत के माध्यम से गुजरती हैं क्रम में करने के लिए अपने हटाने की सुविधा के लिए चाहिए. एक पार्श्व फैशन में meninges बंद छील करने के लिए ठीक इत्तला दे दी संदंश का प्रयोग करें. यदि सावधानी से किया है, इस परत एक टुकड़ा में हटाया जा सकता है. इस कदम के दौरान, घ्राण बल्ब हटा दें. मस्तिष्क ventral पक्ष के साथ, एक गहरी बाण के समान चीरा है जहां प्रांतस्था diencephalon के उदर क्षेत्र (चित्र 1b) से मिलता है. मस्तिष्क पक्ष पृष्ठीय पार्श्व फैशन (चित्र -1 सी, ग ') के लिए एक औसत दर्जे का ऊतक prying द्वारा midbrain से cortices अलग. इस कदम पर किसी भी अवशिष्ट meninges निकालें. लगभग 4 टुकड़ों में प्रत्येक प्रांतस्था पासा और धीरे से एक 15 एमएल शंक्वाकार सदस्य प्रति माउस मस्तिष्क के 350 μL युक्त ट्यूब को हस्तांतरण. बर्फ पर ट्यूब रखें जब तक सभी चूहों को संसाधित किया गया है. दोहराएँ 1.1-1.8 शेष चूहों के लिए एक कदम है. 2. मिश्रित glial संस्कृतियों के नवजात cortices और रखरखाव की हदबंदी नोट: सेल निलंबन में बुलबुले की शुरूआत निम्नलिखित सभी चरणों के दौरान से बचा जाना चाहिए. 15 एमएल शंक्वाकार 3 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान के लिए हौसले से dissected दिमाग युक्त ट्यूब जोड़ें. एक बाँझ ऊतक संस्कृति हुड दिमाग स्थानांतरण. धीरे P1000 विंदुक टिप करने के लिए छोटे टुकड़े उत्पन्न के माध्यम से diced cortices गुजरती हैं. Pipetting एक बार वहाँ कोई मस्तिष्क टुकड़े कर रहे हैं काफी बड़े विंदुक टिप के माध्यम से एक निलंबन के निर्बाध प्रवाह को बाधित करना बंद करो. OPC मस्तिष्क प्रति papain समाधान के शंक्वाकार ट्यूब में 75 μL जोड़ें. OPC papain समाधान होना चाहिए 37 पर पूर्व गरम ° पहले 20 मिनट के लिए सी का उपयोग करने के लिए. 20 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में सेते हैं. लगभग हर 2 मिनट, धीरे से ऊतक एकत्रीकरण को रोकने के लिए ट्यूब पलटना. इस समय के दौरान, प्रत्येक (पीएलएल) पाली एल lysine लेपित (1 मिलीग्राम / एमएल) T25 फ्लास्क (माउस मस्तिष्क के प्रति एक फ्लास्क), और जगह में एक 37 डिग्री सेल्सियस टिशू कल्चर इनक्यूबेटर में मिश्रित glial संस्कृति मीडिया के 5 एमएल जोड़ें 8.5% सीओ 2. 20 मिनट के बाद, बाँझ हुड ऊतक निलंबन वापसी और ट्यूब मिश्रित मस्तिष्क प्रति glial संस्कृति मीडिया के 2 एमएल जोड़ने. चलो कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए बैठने के लिए OPC papain समाधान की निष्क्रियता की अनुमति. विभाज्य 5 एमएल प्लास्टिक की नलियों में ऊतक निलंबन. ट्यूबों की संख्या dissected दिमाग की संख्या मैच, ट्यूब प्रति लगभग 2.5 एमएल में जिसके परिणामस्वरूप चाहिए. एक बाँझ लौ पॉलिश कांच पाश्चर विंदुक का प्रयोग, धीरे प्रत्येक ट्यूब में ऊतक triturate. धीरे धीरे पहली बार में Triturate, और धीरे – धीरे गति को बढ़ाने के रूप में टुकड़े अलग कर देना. Triturate लगभग 10-15 बार, लेकिन इस संख्या में पाचन की प्रभावकारिता के आधार पर भिन्न हो सकते हैं. नोट: के तहत trituration गरीब हदबंदी के ऊतक में परिणाम है, जबकि पर-trituration सेल व्यवहार्यता पर नकारात्मक असर होगा. यह महत्वपूर्ण है समाधान में शुरू करने के लिए नहीं बुलबुले के रूप में इस गंभीर रूप से सेल व्यवहार्यता प्रभाव होगा. एक बार वहाँ नहीं दिखाई ऊतक clumps के निलंबन में शेष रहे हैं, एक 50 एमएल शंक्वाकार मिश्रित मस्तिष्क प्रति glial संस्कृति मीडिया के 4 एमएल (यानी, 4 दिमाग = 16 एमएल मिश्रित glial संस्कृति मीडिया) युक्त ट्यूब को हस्तांतरण. धीरे 50 एमएल शंक्वाकार और शेष 5 एमएल ट्यूबों के लिए ट्यूब दोहराने पलटना. 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूबों (लगभग 15 एमएल ट्यूब प्रति 6.5 एमएल) में जमा सेल निलंबन विभाज्य. 15 एमएल ट्यूब की संख्या dissected दिमाग की संख्या मैच चाहिए. 5 मिनट के लिए 1200 rpm (~ 300 ग्राम) पर अपकेंद्रित्र ट्यूबों. ध्यान aspirate सतह पर तैरनेवाला और प्रत्येक 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब गर्म मिश्रित glial संस्कृति मीडिया के 1 एमएल जोड़ने. धीरे धीरे एक P1000 विंदुक टिप के साथ गोली resuspend, बुलबुले परिचय नहीं सावधान किया जा रहा है. प्रत्येक ट्यूब से एक पूर्व equilibrated PLL लेपित T25 फ्लास्क सेल निलंबन जोड़ें, 6 एमएल संस्कृति मीडिया की कुल मात्रा प्रतिपादन. 3-4 घंटे के लिए एक टिशू कल्चर इनक्यूबेटर में बोतल प्लेस कोशिकाओं PLL सब्सट्रेट करने के लिए संलग्न करने की अनुमति है. बाहर pipetting मीडिया, और ताजा मिश्रित बोतल glial संस्कृति मीडिया के 6 एमएल जोड़ने के द्वारा एक पूर्ण मीडिया परिवर्तन प्रदर्शन. इस कदम के मलबे के बहुत निकालता हैtrituration द्वारा कारण है, और संस्कृति व्यवहार्यता को बढ़ावा देता है. यदि राजभाषा / DRGN सह संस्कृतियों वांछित हैं, इस प्रोटोकॉल की धारा 3 देखें. संस्कृति के 3 दिनों के बाद, मीडिया के 4 एमएल हटाने, और ताजा मिश्रित glial संस्कृति मीडिया के 4 एमएल के साथ जगह से एक 2 / 3 मीडिया परिवर्तन करते हैं. इस बिंदु पर, एक astrocyte monolayer बोतल के आधार पर बनाने चाहिए. 6 दिवस पर प्रदर्शन, एक और 2 / 3 मीडिया को बदलने के लिए और 5 / μg एमएल इंसुलिन के अंतिम एकाग्रता के साथ बोतल पूरक. इस बिंदु पर, एक astrocyte monolayer जिनमें से शीर्ष OPCs proliferating किया जाएगा पर स्पष्ट रूप से दिखाई दे, होना चाहिए. 3. DRGN अलगाव नोट: यह उत्पादन करने के लिए राजभाषा / DRGNs सह संस्कृतियों, DRGNs दिन मिश्रित glial संस्कृति पीढ़ी के बाद स्थापित किया जाना चाहिए. दोनों संस्कृति प्रकार स्वतंत्र रूप से बड़े हो रहे हैं, और 9-10 दिनों के बाद संयुक्त. बलिदान P5-P10 माउस संस्थागत दिशा निर्देशों के अनुसार. रीढ़ की हड्डी निकालें, और एक साफ पेट्री डिश को हस्तांतरण. बहुत और मांसपेशियों, हड्डियों के रूप में संभव के रूप में रीढ़ की हड्डी (चित्र 1d, घ ') से दूर छाँटो, है के रूप में इस पृष्ठीय रूट ganglia (DRGs) के विच्छेदन आसानी होगी. एक नया पेट्री डिश ventral पक्ष अप करने के लिए छंटनी की रीढ़ स्थानांतरण. विच्छेदन कैंची का प्रयोग और caudally शुरू, स्पाइनल कॉलम के माध्यम से medially एक अनुदैर्ध्य फैशन में कटौती. संदंश के दो जोड़े का प्रयोग, धीरे जिज्ञासा रीढ़ की रीढ़ की हड्डी को बेनकाब स्तंभ खुला. DRGs के नीचे पाया जा सकता है और रीढ़ की हड्डी पार्श्व. ठीक इत्तला दे दी संदंश का प्रयोग, धीरे DRGs को दूर करते हुए ganglia (चित्र 1e) को नुकसान से बचने. बर्फ के ठंडे हांक एक नया पेट्री डिश में नमक समाधान बफर (HBSS, एंटीबायोटिक मुक्त) को हटा दिया DRGs स्थानांतरण. चीड़फाड़ करनेवाला माउस 40 प्रति DRGs (चित्र 1f) निकालने के उद्देश्य होना चाहिए. एक बार DRGs निकाला गया है, किसी भी जरूरत से ज्यादा लंबी जड़ों (चित्र 1g, छ ') के DRGs ट्रिम contaminating कोशिकाओं की संस्कृति में परिचय (glial कोशिकाओं, fibroblasts) कम से कम. एक 1.5 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब बर्फ के ठंडे HBSS 500 μL युक्त DRGs स्थानांतरण. 4 में 5 मिनट के लिए 1200 rpm (~ 300 छ) ° सी DRGs गोली अपकेंद्रित्र. एक बाँझ ऊतक संस्कृति हुड अपकेंद्रित्र ट्यूबों स्थानांतरण और ट्यूब से HBSS हटाने के. पूर्व गर्म 500 μL जोड़ें (37 में 20 मिनट ° सी) DRG papain समाधान है, और एक 10 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में ट्यूबों को सेते हैं. ट्यूब हर 2 मिनट ऊतक एकत्रीकरण को रोकने के उलटें. 3.10 कदम दोहराएँ. DRG papain समाधान निकालें और पूर्व गर्म Collagenase एक समाधान (37 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट) के 500 μL जोड़ें. 10 मिनट, inverting के हर 2 मिनट के लिए एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में सेते हैं. 3.10 कदम दोहराएँ. सतह पर तैरनेवाला निकालें और DRGN मीडिया के 1 एमएल जोड़ने. ट्यूब कई बार उलटें. 3.10 कदम दोहराएँ. 3.16 कदम दोहराएँ. एक बाँझ लौ पॉलिश HBSS कई बार में 0.25% BSA के समाधान pipetting द्वारा गोजातीय सीरम albumin (BSA) के साथ कांच पाश्चर विंदुक कोट. BSA समाधान के साथ कोटिंग ग्लास विंदुक दीवारों का पालन से DRGs रोकने जाएगा. BSA लेपित विंदुक के साथ DRGs धीरे पहली बार में, Triturate और बढ़ती तीव्रता के साथ एक बार clumps अलग शुरू. लगभग 10-15 बार Triturate, लेकिन इस संख्या में पाचन की डिग्री पर निर्भर है, और ट्यूब प्रति DRGs की संख्या है. एक बार हदबंदी हासिल की है, एक 50 सुक्ष्ममापी एक बाँझ पेट्री DRGN मीडिया के 7 एमएल युक्त पकवान में फिल्टर के माध्यम से निलंबन गुजरती हैं. निस्पंदन सेल निलंबन से मलबे के बहुत समाप्त करने, हालांकि यह कदम महत्वपूर्ण नहीं है. लगभग 1.25 घंटे के लिए 8.5% सीओ 2 में पेट्री डिश सेते हैं . कोट कई LN2 (10 / पीबीएस में μg एमएल) के साथ 24 अच्छी तरह से एक डिश में 12 मिमी इस ऊष्मायन समय के दौरान coverslips. एक बार ऊष्मायन समाप्त हो गया है, उज्ज्वल क्षेत्र के तहत पेट्री डिश निरीक्षण करते हैं. DRGNs बड़े शरीर, चरण अंधेरे कोशिकाओं के रूप में पहचाने जाते हैं. भंवर धीरे पेट्री डिश के लिए किसी भी पालन DRGNs लिफ्ट. नोट: कई contaminating कोशिकाओं पेट्री डिश के लिए दृढ़ता से पालन होगा, जिससे DRGNs के लिए अपने सेल निलंबन समृद्ध. एक 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब सेल निलंबन स्थानांतरण. धीरे DRGN मीडिया के 4 एमएल के साथ पकवान कुल्ला किसी भी अवशिष्ट DRGNs इकट्ठा. शंक्वाकार ट्यूब करने के लिए अतिरिक्त 4 एमएल स्थानांतरण. 1200 rpm (~ 300 ग्राम) पर 5 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र. सतह पर तैरनेवाला Aspirate और ताजा DRGN मीडिया के 500 μL में गोली resuspend. झुकेंगे एक hemocytometer का उपयोग DRGNs की संख्या की गणना. केवल DRGNs, और नहीं अन्य प्रकार की कोशिकाओं की गिनती करने के लिए सुनिश्चित करें. DRGNs उनके बड़े गोलाकार सेल निकायों द्वारा पहचाना जा सकता है है. DRGN मीडिया के 1 एमएल में प्रत्येक coverslip LN2 लेपित, और एक 37 डिग्री सेल्सियस टिशू कल्चर इनक्यूबेटर में जगह के लिए 8.5% 2 रातोंरात सीओ पर 30,000-50,000 DRGNs बीज . अगली सुबह, DRGN की जगह के द्वारा एक पूर्ण मीडिया परिवर्तन प्रदर्शन1% पेन / Strep और 10 सुक्ष्ममापी FuDR के अंतिम एकाग्रता के साथ राजभाषा मीडिया (शून्य CNTF) के साथ मीडिया. दिन 3 और 5 पर, 3.30 चरण में के रूप में एक ही मीडिया के साथ एक 3 / 4 मीडिया परिवर्तन करते हैं. 7 दिन में राजभाषा मीडिया (ऋण CNTF, पेन / Strep, FuDR) के साथ एक पूर्ण मीडिया परिवर्तन करते हैं. दिन 9 DRGNs एक व्यापक neurite बिस्तर का गठन होना चाहिए, और अब OPCs के साथ सह सुसंस्कृत होने के लिए तैयार हैं. 4. OPCs की राजभाषा समृद्ध संस्कृतियों या राजभाषा DRGN / सह संस्कृतियों की स्थापना के लिए मिश्रित glial संस्कृतियों से शोधन मिश्रित glial संस्कृति के 9 दिन, एक 5% सीओ 2 टिशू कल्चर इनक्यूबेटर में एक कक्षीय हिलनेवाला बोतल हस्तांतरण. खाली T25 बोतल के शीर्ष पर बोतल प्लेस प्रतिकूल मिश्रित glial संस्कृतियों को प्रभावित करने से किसी भी कक्षीय हिलनेवाला से उत्पन्न गर्मी को रोकने के लिए. संस्कृतियों 1 घंटे के लिए इस नए इनक्यूबेटर संतुलित करने के लिए अनुमति दें. एक बार बोतल equilibrated है, 45 मिनट के लिए 50 rpm पर बोतल हिला. इस शेक के उद्देश्य monolayer से किसी भी शिथिल पक्षपाती contaminating कोशिकाओं को हटाने है. एक टिशू कल्चर हुड के लिए कोशिकाओं को ले जाएँ और बोतल से सभी मीडिया हटायें. ताजा मिश्रित glial संस्कृति 5 μg / एमएल इंसुलिन के साथ पूरक मीडिया के 4 एमएल के साथ बदलें. बोतल हिलनेवाला पर वापस प्लेस, और संतुलित करने के लिए लगभग 3 घंटे के लिए अनुमति देने के. एक बार बोतल equilibrated हैं, उन्हें सुरक्षित कक्षीय प्रकार के बरतन, जकड़ना और 220 rpm (रातोंरात) में लगभग 16 घंटे के लिए बोतल हिला. अगली सुबह, अगर ols DRGNs के अभाव (यानी, राजभाषा समृद्ध संस्कृति), कोट कई बाँझ LN2 1 घंटे के लिए (10 / पीबीएस में μg एमएल) के साथ 12 मिमी coverslips में उगाया जा रहे हैं. 24 अच्छी तरह व्यंजन के लिए coverslips स्थानांतरण, Pbs के साथ धोने राजभाषा मीडिया धोने के द्वारा पीछा किया. हर अच्छी तरह से राजभाषा मीडिया के 1 एमएल जोड़ें और 8.5% सीओ 2 पर संतुलित. 5% से कम 10 सेमी टिशू कल्चर व्यंजन संतुलित 30 मिनट के लिए सीओ 2. एक पकवान हर 2 बोतल के लिए आवश्यक हो जाएगा. इन निलंबित OPCs के अंतर आसंजन के संवर्धन के लिए इस्तेमाल किया जाएगा. एक बार 30 मिनट संतुलन अवधि बीत चुका है, हिल बोतल से मीडिया बर्तन को हस्तांतरण. प्रत्येक पकवान 2 बोतल से मीडिया को प्राप्त करते हैं, लगभग 10 सेमी पकवान प्रति सेल निलंबन के 8 एमएल बराबर चाहिए. 5% 30 मिनट के लिए सीओ 2 में बर्तन सेते हैं, जबकि 15 मिनट के निशान पर एक सौम्य कुहनी से हलका धक्का प्रदान. यह कुहनी से हलका धक्का के पालन से 10 सेमी पकवान OPCs को रोकने में मदद मिलेगी. एक बार ऊष्मायन पूरा हो गया है, उज्ज्वल क्षेत्र के अंतर्गत व्यंजन जांच. OPCs आमतौर पर 3-5 कोशिकाओं के छोटे सेल clumps, के रूप में पहचाने जाते हैं लेकिन कभी कभी बड़े neurospheres जैसी समुच्चय के रूप में. कई गैर राजभाषा वंश कोशिकाओं मजबूती प्लेट के आधार पर पालन किया जाना चाहिए. धीरे ज़ुल्फ़ प्लेटें किसी भी शिथिल पालन OPCs अलग करने के लिए, और प्रत्येक थाली से एक 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में सेल निलंबन हस्तांतरण. 5 मिनट के लिए 1200 rpm (~ 300 ग्राम) पर अपकेंद्रित्र. 1 राजभाषा मीडिया की एमएल में P1000 पिपेट टिप, P200 विंदुक टिप के साथ resuspension द्वारा पीछा के साथ गोली Resuspend. एक hemocytometer का उपयोग कोशिकाओं को गिन लो. समृद्ध राजभाषा संस्कृतियों, बीज 25,000 – 1 एमएल राजभाषा मीडिया के अंतिम मात्रा में प्रत्येक 12 मिमी LN2 लेपित coverslip 50,000 OPCs. राजभाषा / DRGN सह संस्कृतियों, अनुभाग से DRGNs पर एक पूर्ण राजभाषा (शून्य CNTF) मीडिया परिवर्तन प्रदर्शन [3], और धीरे OPC समृद्ध सेल निलंबन से 50,000 कोशिकाओं को जोड़ने. OPCs के अलावा दौरान बाधित करने के लिए नहीं DRGN neurite बिस्तर ख्याल रखना. 8.5% सीओ 2 पर प्लेस एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में, संस्कृतियों और निर्धारण जब तक हटाने से बचने के. Murine OPCs pH में परिवर्तन, और इनक्यूबेटर से हटाने के प्रति संवेदनशील हैं राजभाषा मीडिया के पीएच बदल जाएगा. नोट के अलावा, DH 2 हे खाली सेल संस्कृतियों आसपास के कुओं के अलावा संस्कृति मीडिया के वाष्पीकरण को रोकने, इस प्रकार राजभाषा मीडिया के भीतर कम से कम सांद्रता विलेय में उतार चढ़ाव होगा. यह OPCs के लिए एक और अधिक सुसंगत वातावरण प्रदान करेगा. 5. Immunofluorescence माइक्रोस्कोपी के लिए संस्कृतियों के प्रसंस्करण -20 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट, या 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर 3% paraformaldehyde के लिए 100% मेथनॉल के साथ संस्कृतियों को ठीक करें. 0.1% 10 मिनट के लिए ट्राइटन-X-100 के साथ coverslips Permeabilize, 1 घंटे के लिए फॉस्फेट-buffered खारा (पीबीएस) और ब्लॉक के साथ 10% बकरी सीरम में धो. प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ सेते coverslips 4 बजे समाधान रातोंरात अवरुद्ध में पतला डिग्री सेल्सियस Coverslips पीबीएस के साथ 3 बार धो, और Alexa fluor संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी (Invitrogen) 45 मिनट के लिए समाधान को रोकने में पतला के साथ सेते हैं. 4 ',6-diamidino-2 – phenylindole (DAPI) के साथ Counterstain और coverslips पीबीएस के साथ कई बार धोने. DAKO फ्लोरोसेंट में माउंट coverslips बढ़ते मध्यम. Immunofluorescence माइक्रोस्कोपी के माध्यम से स्लाइड्स का विश्लेषण करें. इस प्रोटोकॉल में, स्लाइड या तो एक Zeiss Axiovert 200M औंधा प्रतिदीप्ति के साथ विश्लेषण किया गयामाइक्रोस्कोप या एक Zeiss LSM 510 मेटा confocal खुर्दबीन स्कैनिंग लेजर. 6. राजभाषा समृद्ध संस्कृतियों से पूरे सेल प्रोटीन निष्कर्षण इनक्यूबेटर और शांत से 3 मिनट के लिए बर्फ पर 24 अच्छी तरह से संस्कृतियों निकालें. ध्यान से मीडिया को निकालने के लिए, और lysis बफर का 10-20 μL (50 मिमी Tris – एचसीएल, 150 मिमी NaCl, 0.1% एसडीएस, 0.5% सोडियम deoxycholate, 1% Triton एक्स 100, 0.1% pepstatin के साथ, aprotinin, PMSF जोड़ने के लिए, leupeptin, सोडियम orthovanadate प्रत्येक अच्छी तरह से) (8 नमूना प्रति कुओं की एक न्यूनतम का सुझाव दिया है). एक विस्तृत बोर P1000 विंदुक टिप का उपयोग कुओं परिमार्जन, और एक 1.5 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब lysate हस्तांतरण. एक 30 साढ़े गेज सिरिंज के माध्यम से lysate लगभग 15 बार, और 30 मिनट के लिए बर्फ पर ठंडा दर्रा. +१४००० आरपीएम (~ 20,000 छ) में 15 मिनट 4 डिग्री सेल्सियस के लिए ट्यूबों अपकेंद्रित्र -80 में नया अपकेंद्रित्र ट्यूबों, और स्टोर करने के लिए सतह पर तैरनेवाला स्थानांतरण डिग्री सेल्सियस 7. एसडीएस पृष्ठ समृद्ध राजभाषा संस्कृति प्रोटीन पर विश्लेषण एसडीएस पृष्ठ से मानक 12% पाली acrylamide जैल पर बफर को कम करने में नमूना प्रति प्रोटीन की 30 μg संकल्प. अर्ध – शुष्क PVDF झिल्ली पर हस्तांतरण जैल. 1 घंटे के लिए 5% में ब्लॉक झिल्ली TBST में दूध पाउडर मलाई उतारा (10 मिमी Tris – एचसीएल 8.0 पीएच, 150 मिमी NaCl, 0.1% बीच – 20). 1 घंटे के लिए समाधान अवरुद्ध में प्राथमिक पतला एंटीबॉडी के साथ झिल्ली सेते हैं. झिल्ली 10 मिनट के लिए TBST के साथ 3 बार धोएं. एचआरपी संयुग्मित अवरुद्ध समाधान में 45 मिनट के लिए माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ झिल्ली सेते हैं. झिल्ली TBST के साथ कई बार धो, और 5 मिनट के लिए Amersham ईसीएल प्लस पश्चिमी सोख्ता पता लगाने अभिकर्मक (जीई हेल्थकेयर) के साथ सेते हैं. मानक वैज्ञानिक इमेजिंग फिल्म के साथ प्रोटीन बैंड का पता लगाएँ. 8. प्रतिनिधि परिणाम: इस प्रोटोकॉल में, OPCs एक मिश्रित glial संस्कृति के भीतर एक astrocyte monolayer पर विस्तार कर रहे हैं. इस मिश्रित संस्कृति glial P0-P2 नवजात माउस प्रांतस्था से ली गई है. इन विट्रो (DIV1) में 1 दिन, मिश्रित संस्कृति glial अलग morphologies के साथ कोशिकाओं चरण विपरीत माइक्रोस्कोपी (चित्र 2a) के द्वारा देखा के रूप में शामिल हैं. DIV3 में, एक astrocyte monolayer फ्लास्क के आधार पर फार्म शुरू होता है, और DIV8 पर OPCs monolayer की सतह पर स्पष्ट रूप से मनाया जा सकते हैं. DIV9, proliferating OPCs पर्याप्त घनत्व तक पहुँच चुके हैं रातोंरात उच्च गति कक्षीय झटकों से शुद्ध हो. एक बार शुद्धिकरण की प्रक्रिया पूर्ण हो गया है, परिणाम एक सेल OPC समृद्ध आबादी है. DIV1 – पोस्ट शुद्धि, OPCs सरल आकारिकी है, कुछ प्रक्रियाओं (चित्र 2b) का विस्तार. DIV3 पोस्ट शुद्धि में, कोशिकाओं में प्रक्रियाओं के एक जटिल meshwork, अपरिपक्व ols की याद ताजा बढ़ाया है. DIV6 पोस्ट शुद्धि, शुद्ध ols चपटा है और पत्रक झिल्ली संरचनाओं की तरह का अनुमान है. इस morphological विकास ols के इन विट्रो परिपक्वता में विशिष्ट है. Immunofluorescence माइक्रोस्कोपी यह संकेत करता है कि शुद्ध कोशिकाओं की राजभाषा वंश (चित्र 3a) हैं. वरीयता प्राप्त शुरू OPCs व्यक्त chondroitin सल्फेट proteoglycan (NG2), और तीन दिन पोस्ट बोने (चित्र 3b) के भीतर माइलिन जुड़े (पत्रिका) ग्लाइकोप्रोटीन सकारात्मक अपरिपक्व ols में विकसित. DIV6 कम, कई ols व्यक्त माइलिन बुनियादी (MBP), प्रोटीन और अधिकारी ठेठ परिपक्व राजभाषा आकारिकी. राजभाषा समृद्ध संस्कृतियों (चित्र -3 सी) की पवित्रता निर्धारित प्रतिशत राजभाषा वंश कोशिकाओं को अलग अलग समय बिंदुओं पर मात्रा निर्धारित किया गया. DIV1 पोस्ट शुद्धि, संस्कृतियों 50 कर रहे हैं ± 14% NG2 + ve OPCs कोई पत्रिका + ve या MBP + ve ols. यह संकेत करता है कि शुद्ध राजभाषा वंश कोशिकाओं बोने के समय में अग्रदूत चरण में विभेदित ols की नगण्य संख्या के साथ कर रहे हैं. DIV3, कई ols पत्रिका + ve कोशिकाओं (24 ± 5.9%) में विभेदित किया है जबकि कुछ अग्रदूत phenotype बनाए रखने के लिए, और रहना NG2 + (± 8.0% 13) . DIV3 में, पत्रिका + ve कोशिकाओं (3.2 1.2%) के एक छोटे से अनुपात भी MBP व्यक्त कर रहे हैं. DIV6 में, 20 ± ols के 5.9% पत्रिका + ve जबकि 12 ± 7.3% NG2 + ve OPCs रूप में जारी रहती है. इसके अलावा, 21 ± संस्कृति के भीतर कोशिकाओं के 9.3% MBP + इस समय बिंदु पर किया है ols. एसडीएस पृष्ठ 2'3' चक्रीय nucleotide 3'phosphodiesterase (CNP) और 6 दिन की संस्कृति अवधि में MBP वर्गीकृत अभिव्यक्ति विश्लेषण से पता चलता है, आगे संस्कृति में OPCs टर्मिनली परिपक्व ols में अंतर (चित्र 3 डी की क्षमता का प्रदर्शन ). सामूहिक, इन डेटा एक राजभाषा समृद्ध संस्कृति OPCs से राजभाषा परिपक्वता के अध्ययन के लिए उपयुक्त प्रणाली का निर्माण करने का एक साधन के रूप में में इस विधि स्थापित करता है. इस प्रोटोकॉल / राजभाषा DRGN murine केवल ऊतक स्रोतों का उपयोग कर सह संस्कृतियों को स्थापित करने के तरीकों का वर्णन करता है. हालांकि, क्रम में सह संस्कृति का उत्पादन करने के लिए, DRGNs पहली बार अकेले सुसंस्कृत होना चाहिए पर्याप्त neurite नेटवर्क का उत्पादन. ये प्रसवोत्तर murine न्यूरॉन संस्कृतियों कम सीरम मीडिया में 9 दिनों के लिए 10 सुक्ष्ममापी FuDR अनुपूरण के साथ बड़े हो रहे हैं fibroblasts और जीएल contaminating के प्रसार को रोकने के ial कोशिकाओं. इन विट्रो में 9 दिनों के दौरान, पृथक DRGNs एक घने neurite बिस्तर (चित्र 4a) का उत्पादन. इस neurite बिस्तर neuronal मार्कर 200 neurofilament (NF) और Tuj1 (चित्र 4b) के लिए immunopositive है. इस बिंदु पर, शुद्ध OPCs neurite बेड को जोड़ा जा सकता है, और एक अतिरिक्त 6 दिनों सह संस्कृतियों myelinating उत्पादन के लिए सभ्य. DIV6 राजभाषा / DRGN सह संस्कृति, कई MBP + ve ols NF + ve DRGN neurites (चित्र 5a) के बीच मनाया जा सकता है . करीब परीक्षा पर, ols करने के लिए कई DRGN neurites के साथ संपर्क बनाने के लिए, अक्सर उन्हें एक MBP + ve झिल्ली (चित्र 5 ब, ग) के साथ ensheathing सबूत हैं. चित्रा 1. नवजात माउस प्रांतस्था और DRG अलगाव के विशेष पहलुओं के विच्छेदन माइक्रोस्कोप छवियों. (क) एक हौसले से निकाला नवजात माउस मस्तिष्क के पृष्ठीय दृश्य. बिंदीदार लाइनों क्षेत्र है जहां चीरों meningeal परत को हटाने की सुविधा के लिए किया जाना चाहिए संकेत मिलता है (ख) मस्तिष्क के ventral दृश्य, बिंदीदार लाइनों क्षेत्र है जहां प्रांतस्था वेंट्रल diencephalon मिलता संकेत मिलता है. दीप चीरों के रूप में बिंदीदार लाइनों के साथ बनाया जाना चाहिए cortices के अलगाव सहायता (सी ग ') कैसे जिज्ञासा प्रांतस्था मस्तिष्क के शेष से दूर के दृश्य चित्रण (घ) एक हौसले से अलग P5 -P10 माउस रीढ़ पहले दूर अतिरिक्त मांसपेशियों और हड्डियों (घ) trimming (ई) DRGs के स्थान स्पाइनल कॉलम के अंदर. (च) DRGs है कि एक माउस से अलग किया जाना चाहिए की अनुमानित संख्या (छ) एक DRG लंबे जड़ों की आवश्यकता है कि साथ enzymatic पाचन से पहले trimming के. बिंदीदार रेखा क्षेत्र जहाँ जड़ों छंटनी होना चाहिए इंगित करता है (छ) जड़ – trimming पोस्ट DRG. चित्रा 2. OPCs एक मिश्रित glial संस्कृति के भीतर का विस्तार कर रहे हैं, शुद्ध, और बाद में एक समृद्ध संस्कृति राजभाषा के रूप में विभेदित. (क) विकास के विभिन्न चरणों को चरण मिश्रित glial संस्कृतियों के विपरीत छवियाँ. DIV1, कुछ चपटा कोशिकाओं के साथ कोशिकाओं दौर दिखाई देते हैं. मिश्रित glial संस्कृति के स्तरीकरण DIV3, जहां astrocytes फ्लास्क, जिस पर OPCs पैदा के आधार पर एक समान monolayer फार्म पर शुरू होता है. कई OPCs DIV8 (तीर) astrocyte monolayer की सतह का पालन पर देखा जाता है (ख) एक बार मिश्रित glial संस्कृति से शुद्ध. DIV1 OPCs केवल कुछ प्रक्रियाओं को बढ़ाया है. DIV3 में, कोशिकाओं को कई प्रक्रियाओं, मध्यवर्ती चरण ols की याद ताजा बढ़ाया है. DIV6, चपटा ols (तारांकन) झिल्लीदार शीट का उत्पादन किया है (डैश्ड लाइन) दिखाई देते हैं. स्केल सलाखों, 50 सुक्ष्ममापी. चित्रा 3. राजभाषा – समृद्ध संस्कृति की विशेषता है . (क) विकास के विभिन्न चरणों में पृथक ols के Confocal छवियों. NG2 + ve OPCs सरल आकारिकी है, जबकि पत्रिका + ve ols कई arborous प्रक्रियाओं अधिकारी. MBP + ve ols झिल्लीदार माइलिन तरह चादरें बढ़ाया है. स्केल पट्टी, 50 सुक्ष्ममापी. (ख) शुद्ध राजभाषा वंश कोशिकाओं OPCs के रूप में उत्पन्न है, और 6 DIV अधिक पत्रिका + ve, MBP + ve ols में अंतर है . DIV1, सभी OPCs NG2 + ve हैं, जबकि कोई भी पत्रिका + ve या + MBP किया है. DIV3 में, पत्रिका + किया है और कुछ MBP + ve ols अब स्पष्ट हैं. ols के बहुमत DIV6 में पत्रिका और MBP + ve कुछ शेष + NG2 किया है OPCs के साथ कर रहे हैं. स्केल बार, 100 सुक्ष्ममापी (ग) ± 6 DIV से अधिक विकास के विभिन्न चरणों में राजभाषा – वंश प्रतिशत कोशिकाओं के मूल्यों एसडी मीन. DIV1 में, सभी राजभाषा वंश कोशिकाओं NG2 + 50 के लिए किया है लेखांकन, ± संस्कृति के भीतर कुल कोशिकाओं के 14% हैं. DIV3 और DIV6 कम, राजभाषा वंश कोशिकाओं को क्रमश: 36 के लिए खाते ± 6.8% और 32 ± कुल कोशिकाओं के 8.4%, NG2 के अनुपात अलग से मिलकर + ve, पत्रिका + ve और MBP + ve ols. (घ) एसडीएस पृष्ठ प्रदर्शन प्रोटीन पर समृद्ध 6 DIV संस्कृति अवधि में राजभाषा-मार्करों CNP MBP और वर्गीकृत अभिव्यक्ति का प्रदर्शन राजभाषा संस्कृतियों से निकाली गई. चित्रा 4. DRGN संस्कृति पूर्व OPC बोने की विशेषता. (क) 9 DIV संस्कृति पूर्व OPC के बोने की अवधि से अधिक DRGNs छवियों के विपरीत चरण . DRGNs कुछ प्रक्रियाओं के साथ बड़े शरीर की कोशिकाओं के रूप में उत्पन्न है, और एक तेजी से जटिल neurite नेटवर्क का उत्पादन. स्केल बार, 100 सुक्ष्ममापी. (ख) DRGN DIV9 में तय (पूर्व OPC बोने) और न्यूरॉन विशेष Tuj1 और NF200 मार्करों के लिए दाग संस्कृतियों की छवियों Confocal . DRGNs neurite नेटवर्क पर जो OPCs / राजभाषा DRGN सह संस्कृतियों myelinating उत्पादन वरीयता प्राप्त हो सकता है का उत्पादन किया है. स्केल बार, 50 सुक्ष्ममापी. "ent> चित्रा 5. OLS राजभाषा के साथ DRGN neurites MBP + ve झिल्ली की लपेटन की मध्यस्थता में DRGNs परिणाम के साथ सह – सुसंस्कृत. (क) एक 4 – क्षेत्र confocal DIV6 / राजभाषा DRGN सह संस्कृति के असेंबल छवि. कई MBP + ve ols अंतर्निहित DRGN neurite बिस्तर के साथ बातचीत देखा जा सकता है है. स्केल बार, 100 सुक्ष्ममापी. (ख) एक बढ़ाया MBP के confocal दृश्य + ve कई DRGN neurites लपेटकर ols. स्केल पट्टी, 50 सुक्ष्ममापी. (ग) क्षेत्र के डिजिटल बढ़ाई (ख) जहां एक DRGN neurite राजभाषा झिल्ली के साथ किया जा रहा लपेटा जाता है में चिह्नित. स्केल बार, 25 सुक्ष्ममापी

Discussion

यह रिपोर्ट राजभाषा समृद्ध संस्कृतियों या राजभाषा DRGN / सह संस्कृतियों में भेदभाव के लिए murine OPCs अलग करने के लिए एक विधि का वर्णन करता है. जब अकेले सुसंस्कृत, OPCs MBP में अंतर ^{+ ve} ols, myelin की तरह झिल्लीदार शीट उत्पादन. जब neurite बेड DRGN जोड़ी ols MBP साथ DRGN neurites लपेटना ^{+ ve} झिल्ली. यह मॉडल जटिल राजभाषा की मध्यस्थता axonal ensheathment शासी आधार की जांच लाभ है.

जबकि महान मूल्य का है, ऐसे संस्कृतियों की स्थापना तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण है. विशेष रूप से, मांग पहलुओं कुशल पाचन ऊतक / पृथक्करण, संतुलित संस्कृति मीडिया पीएच के रखरखाव, और DRGN मीडिया परिवर्तन शामिल हैं. यह महत्वपूर्ण है कि पाचन की लंबाई, ऊतक की मात्रा को पचा जा रहा है trituration की राशि ऊतक पृथक्करण की प्रभावकारिता और अंतिम परिणाम को प्रभावित करता है पर विचार करने के लिए के लिए. यह अनुभवी शोधकर्ताओं के लिए असामान्य नहीं है dissociated तंत्रिका तंत्र के ऊतकों से कम सेलुलर पैदावार प्राप्त करने के लिए. इसके अलावा, murine OPCs alkaline शर्तों के तहत विशेष रूप से, संस्कृति मीडिया के पीएच में परिवर्तन के प्रति संवेदनशील हो जाते हैं. 8.5% सीओ ₂ में संस्कृतियों के रखरखाव के इस रोकने के लिए, क्योंकि OPCs करने के लिए बेहतर बुनियादी पर थोड़ा अम्लीय परिस्थितियों को बर्दाश्त प्रकट करना. खिला DRGNs संबंध के साथ, मीडिया परिवर्तन जल्दी से प्रदर्शन किया जाना चाहिए के रूप में न्यूरॉन्स नहीं कुम्हलाना, तथापि, कोमल के रूप में विकसित neurite बिस्तर बाधित नहीं होना चाहिए. अचानक मीडिया परिवर्तन सब्सट्रेट से neurite बिस्तर, और अपने coverslip से पूरा पृथक्करण में होने की संभावना परिणाम बेदखल हो सकता है.

इस मॉडल प्रणाली के संभावित योग्यता बहुत अपनी तकनीकी मांग प्रकृति overshadows. इस प्रणाली का एक लाभ यह सेल संस्कृति व्युत्पत्ति के लिए प्रसवोत्तर चूहों का उपयोग है, प्रजनन मादा भ्रूण ऊतक फसल के बलिदान की जरूरत circumventing. एक और लाभ यह वृद्धि कारकों के लिए आवश्यकता के OPCs के विस्तार के लिए (GFS) कमी है. मिश्रित glial संस्कृतियों एक वातावरण है कि OPCs, संभाव्यतः astrocyte व्युत्पन्न पौष्टिकता संबंधी कारकों की उपस्थिति के कारण के प्रसार का समर्थन करता है प्रदान करते हैं. व्युत्पत्ति के माध्यम से ^7,8 neurospheres जैसे अन्य तरीकों, जैसे बुनियादी fibroblast वृद्धि कारक (bFGF), epidermal वृद्धि कारक (EGF) और OPC के विस्तार के लिए प्लेटलेट व्युत्पन्न वृद्धि कारक (PDGF) GFS का mitogenic गुणों पर निर्भर हैं . इसी तरह, प्रसवोत्तर (P5-10) DRGNs के लिए चूहों का उपयोग तंत्रिका वृद्धि कारक (NGF), एक neurotrophic इन विट्रो भ्रूण ^{DRGNs 9, 10} के अस्तित्व के लिए आवश्यक कारक के साथ संस्कृति मीडिया का सप्लीमेंट की आवश्यकता टाल. यह NGF का उपयोग कर के रूप में यह नकारात्मक ols के myelinating क्षमता को प्रभावित ^करती है जब 4 DRGNs साथ सुसंस्कृत से बचने के लिए ब्याज की है. के प्रयोग से परहेज GF पूरक मीडिया भी आर्थिक लाभ है, के रूप में इन अभिकर्मकों महंगा हो गया है जब बड़े पैमाने पर इस्तेमाल किया.

शायद इस संस्कृति मॉडल की सबसे महत्वपूर्ण लाभ माउस केवल ऊतकों से इसकी व्युत्पत्ति है, इस प्रकार ट्रांसजेनिक माउस लाइनों की एक विस्तृत विविधता से दोनों OPCs और DRGNs प्राप्त अवसरों को उपलब्ध कराने. यह दोनों DRGN और / या OPC के विशेष गुण है कि myelination सरकार के अध्ययन के लिए अनुमति देता है. यह रिसेप्टर ligand / बातचीत axons की राजभाषा की मध्यस्थता myelination विनियमन elucidating के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण हो जाएगा. सभी में, इस तकनीक आणविक myelination अंतर्निहित cues को समझने की दिशा में अपने आवेदन करने के लिए कारण तंत्रिका विज्ञान अनुसंधान के संबंध के साथ महान मूल्य का है.

Materials

Product Name	Company	Product Number
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)	Multicell	319-005-CL
Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS)	Invitrogen	14170-112
Minimum Essential Media (MEM)	GIBCO	12360-038
Fetal Bovine Serum (FBS)	GIBCO	10091-148
Penicillin-Streptomycin (Pen/Strep)	GIBCO	15140-122
GlutaMAX	Invitrogen	35050-061
Poly-l-lysine	Sigma-Aldrich	P2636
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A4503
Human merosin purified protein (LN2)	Millipore	CC085
Recombinant rat ciliary neurotrophic factor (CNTF)	PeproTech	450-50
L-thyroxine	Biochemika	89430
Holo-transferrin	Sigma-Aldrich	T0665
B27 supplement	GIBCO	0080085-SA
Bovine insulin	Sigma-Aldrich	I6634
3,3′,5-Triiodo-L-thyronine	Sigma-Aldrich	I6634
Progesterone	Sigma-Aldrich	P8783
Putrescine	Sigma-Aldrich	P7505
Sodium Selenite	Sigma-Aldrich	S5261
5-Fluoro-2′-deoxyuridine (FuDR)	Sigma-Aldrich	F0503
Papain solution	Worthington	LS003126
DNaseI	ROCHE	1010159001
L-cysteine	Sigma-Aldrich	C7352
24-well tissue culture dishes	Cellstar	662-160
T25-tissue culture flasks with vent cap	Corning	430639
10 cm tissue culture dishes	Corning	430167
10 cm petri dish	Fisher Scientific	0875713
Collagenase A	ROCHE	103578
CellTrics 50 μm filter (optional)	PARTEC	04-004-2327
Myelin Basic Protein (MBP) Antibody	AbD Serotec	MCA409S
NG2 antibody	Millipore	AB5320
Myelin-Associated Glycoprotein (MAG) antibody	Millipore	MAB1567
2′,3′-Cyclic-nucleotide 3′-phosphodiesterase (CNP) antibody	Covance	SMI-91R-100
Actin pan Ab-5 antibody	Fitzgerald	10R-A106AX
Neurofilament-200 (NF) antibody	Sigma-Aldrich	N4142
Tubulin beta-3 chain (Tuj1) antibody	Millipore	MAB5544
Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG (H+L) secondary antibody	Invitrogen	A11008
Alexa Fluor 555 goat anti-mouse IgG (H+L) secondary antibody	Invitrogen	A21422
Alexa Fluor 647 goat anti-rat (IgG) (H+L) secondary antibody	Invitrogen	A21247
Goat anti-mouse IgG (H+L)-HRP conjugated secondary antibody	BioRad	170-6516
Goat anti-rat IgG (H+L)-HRP conjugated secondary antibody	Santa Cruz Biotechnology	SC-2065
4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)	Sigma-Aldrich	D9542

Media Recipes

100X OL-Supplement*

Ingredient	Amount to add
DMEM	100 mL
BSA	1.02 g
Progesterone	0.6 mg
Putrescine	161 mg
Sodium Selenite	0.05 mg
3,3′,5-Triiodo-L-thyronine	4 mg

*Store at -80°C in 250 μL aliquots

OL media

Ingredient	Amount to add
DMEM	23.75 mL
100X OL-Supplement	250 μL
Bovine insulin (from 1 mg/mL stock)	125 μL
GlutaMAX	250 μL
Holo-transferrin (from 33 mg/mL stock)	37.5 μL
B27 Supplement	500 μL
FBS	125 μL
CNTF (from 50 ng/μL stock)	25 μL

Mixed glial culture media (made up in DMEM)

Ingredient	Final concentration
FBS	10%
Pen/Strep (0.33% from stock)	33 units/mL Penicillin and 33 μg/mL Streptomycin
GlutaMAX	1%

DRGN media (made up in DMEM)

Ingredient	Final concentration
FBS	10%
Pen/Strep (1% from stock)	100 units/mL Penicillin and 100 μg/mL Streptomycin

Digestion Solution Recipes:

OPC papain solution (made up in MEM)

Ingredient	Final concentration
Papain solution	1.54 mg/mL
L-cysteine	360 μg/mL
DNaseI	60 μg/mL

DRG papain solution (made up in HBSS)

Ingredient	Final concentration
Papain	1.54 mg/mL
L-cysteine	360 μg/mL

DRG Collagenase A solution (made up in HBSS)

Ingredient	Final concentration
Collagenase A	4 mg/mL