जीवित कोशिकाओं में ubiquitin-एंटीबॉडी गतिविधि की निगरानी एक Degron (DGN) अस्थिर ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन रिपोर्टर (GFP) आधारित प्रोटीन का उपयोग
Summary
Ubiquitin-एंटीबॉडी जीवित कोशिकाओं में गतिविधि पर नजर रखने के लिए एक विधि का वर्णन है. एक degron अस्थिर GFP (GFP-DGN) और एक स्थिर GFP-dgnFS संलयन प्रोटीन उत्पन्न कर रहे हैं और एक lentiviral अभिव्यक्ति वेक्टर का उपयोग सेल में transduced. इस तकनीक के लिए एक स्थिर GFP-dgn/GFP-dgnFS व्यक्त सेल लाइन में जो ubiquitin-एंटीबॉडी गतिविधि epifluorescence या प्रवाह cytometry का उपयोग आसानी से किया जा मूल्यांकन कर सकते हैं उत्पन्न करने के लिए अनुमति देता है.
Abstract
एंटीबॉडी मुख्य intracellular organelle असामान्य, misfolded, क्षतिग्रस्त या ऑक्सीकरण हो जाता है 1 प्रोटीन, 2 की गिरावट proteolytic में शामिल है. सेल तनाव 3 प्रतिक्रिया, कोशिका चक्र विनियमन और सेलुलर भेदभाव 4 या प्रतिरक्षा प्रणाली जवाब में 5 की तरह, एंटीबॉडी गतिविधि के रखरखाव में कई महत्वपूर्ण सेलुलर प्रक्रियाओं में फंसा था. ubiquitin-एंटीबॉडी प्रणाली की शिथिलता ट्यूमर और neurodegenerative रोगों के 4, 6 के विकास के लिए संबंधित दिया गया है. इसके अतिरिक्त, एंटीबॉडी गतिविधि में एक कमी सेलुलर senescence और organismal उम्र बढ़ने के 7, 8, 9, 10 की एक विशेषता के रूप में पाया गया था. यहाँ, हम रहने वाले एक GFP-DGN संलयन प्रोटीन का उपयोग कोशिकाओं में ubiquitin-एंटीबॉडी की गतिविधि को मापने के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं. प्राथमिक जीवित कोशिकाओं में ubiquitin-एंटीबॉडी की गतिविधि पर नजर रखने में सक्षम हो सकता है, पूरक डीएनए एक हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) DGN संलयन प्रोटीन के लिए कोडिंग constructs (GFPDGN, अस्थिर) और एक एक frameshift उत्परिवर्तन (GFP dgnFS, 11 स्थिर) ले जाने variant lentiviral अभिव्यक्ति वैक्टर में डाला जाता है. हम पारंपरिक अभिकर्मक तकनीकों पर इस तकनीक को पसंद करते हैं, क्योंकि यह एक बहुत ही उच्च अभिकर्मक दक्षता की गारंटी देता है सेल प्रकार या दाता की उम्र के स्वतंत्र. (स्थिर) GFP-dgnFS प्रोटीन और या एंटीबॉडी अवरोध करनेवाला की अनुपस्थिति में अस्थिर प्रोटीन (GFP DGN) द्वारा प्रदर्शित प्रतिदीप्ति के बीच अंतर करने के लिए एक विशेष सेल तनाव में ubiquitin-एंटीबॉडी गतिविधि का अनुमान लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इन मतभेदों epifluorescence माइक्रोस्कोपी द्वारा नजर रखी जा सकता है या cytometry प्रवाह से मापा जा सकता है.
Protocol
Discussion
1 ubiquitin-एंटीबॉडी गतिविधि के लिए एक संवाददाता सब्सट्रेट के रूप में हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) का उपयोग प्रकाशन 12 2000 में प्रकाशित किया गया था. तब से, GFP सेलुलर गतिविधियों, विशेष रूप से ubiquitin-एंटीबॉडी प्रक्रि?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस अध्ययन के द्वारा वित्त पोषित किया गया था: ऑस्ट्रियाई विज्ञान फाउंडेशन (FWF), यूरोपीय आयोग एकीकृत परियोजनाएं MiMAGE और PROTEOMAGE, नीदरलैंड जीनोमिक्स पहल द्वारा एजिंग (S93 NFN) पर राष्ट्रीय अनुसंधान नेटवर्क / वैज्ञानिक अनुसंधान के लिए नीदरलैंड संगठन (एनजीआई NWO / 05040202 और 050 – 060-810) NCHA, यूरोपीय संघ के नेटवर्क उत्कृष्टता जीवनकाल (036,894) FP6 वित्त पोषित, और अभिनव जीनोमिक्स पर उन्मुख अनुसंधान कार्यक्रम (SenterNovem, IGE01014 और IGE5007).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| pEGFP-C1 Vector | BD Bioscience Clontech | 6084-1 |
| pENTR Directional TOPO Cloning Kit | Invitrogen | K2400-20 |
| pLenti6/V5 Directional TOPO Cloning Kit | Invitrogen | V496-10 |
| Lipofectamine 2000 Reagent | Invitrogen | 11668019 |
| DMEM | Sigma | D5546 |
| PVDF filter (Rotilabo-Spritzenfilter) | Roth | P667.1 |
| Polyethylene glycol | Sigma | P2139 |
| NaCl | Merck | 1.06404.1000 |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline 1x (PBS) | Invitrogen | 14190 |
| hexadimethrine bromide | Sigma | 10,768-9 |
| Blasticidin | Invitrogen | R21001 |
| Crystal violet | Sigma | C3886 |
| FACS tubes | BD Biosciences | |
| Penicillin Streptomycin (Pen-Strep) | Invitrogen | 15140130 |
| L-glutamine 200 mM | Invitrogen | 25030024 |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Biochrom AG | S0115 |
| MEM Non-Essential Amino Acids (NEAA) 100x | Invitrogen | 11140035 |
| MEM Sodium Pyruvate 100 mM | Invitrogen | 11360039 |
| D-(+)-Glucose (45%) | Sigma | G8769 |
| Geneticin | Invitrogen | 11811023 |
| CaCl2 | Merck | C5080 |
| Hepes | Sigma | H3375 |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | Invitrogen | 25300054 |
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