Неоднородность Картирование экспрессии белка в опухолях с использованием количественных иммунофлуоресценции

Summary

Здесь мы опишем метод количественного молекулярной неоднородности в гистологических срезов опухолевого материала с использованием количественных иммунофлюоресценции, анализ изображений, а статистическая мера неоднородности. Метод предназначен для использования в клинической разработке биомаркеров и анализа.

Abstract

Morphologic heterogeneity within an individual tumor is well-recognized by histopathologists in surgical practice. While this often takes the form of areas of distinct differentiation into recognized histological subtypes, or different pathological grade, often there are more subtle differences in phenotype which defy accurate classification (Figure 1). Ultimately, since morphology is dictated by the underlying molecular phenotype, areas with visible differences are likely to be accompanied by differences in the expression of proteins which orchestrate cellular function and behavior, and therefore, appearance. The significance of visible and invisible (molecular) heterogeneity for prognosis is unknown, but recent evidence suggests that, at least at the genetic level, heterogeneity exists in the primary tumor^1,2, and some of these sub-clones give rise to metastatic (and therefore lethal) disease.

Moreover, some proteins are measured as biomarkers because they are the targets of therapy (for instance ER and HER2 for tamoxifen and trastuzumab (Herceptin), respectively). If these proteins show variable expression within a tumor then therapeutic responses may also be variable. The widely used histopathologic scoring schemes for immunohistochemistry either ignore, or numerically homogenize the quantification of protein expression. Similarly, in destructive techniques, where the tumor samples are homogenized (such as gene expression profiling), quantitative information can be elucidated, but spatial information is lost. Genetic heterogeneity mapping approaches in pancreatic cancer have relied either on generation of a single cell suspension³, or on macrodissection⁴. A recent study has used quantum dots in order to map morphologic and molecular heterogeneity in prostate cancer tissue⁵, providing proof of principle that morphology and molecular mapping is feasible, but falling short of quantifying the heterogeneity. Since immunohistochemistry is, at best, only semi-quantitative and subject to intra- and inter-observer bias, more sensitive and quantitative methodologies are required in order to accurately map and quantify tissue heterogeneity in situ.

We have developed and applied an experimental and statistical methodology in order to systematically quantify the heterogeneity of protein expression in whole tissue sections of tumors, based on the Automated QUantitative Analysis (AQUA) system⁶. Tissue sections are labeled with specific antibodies directed against cytokeratins and targets of interest, coupled to fluorophore-labeled secondary antibodies. Slides are imaged using a whole-slide fluorescence scanner. Images are subdivided into hundreds to thousands of tiles, and each tile is then assigned an AQUA score which is a measure of protein concentration within the epithelial (tumor) component of the tissue. Heatmaps are generated to represent tissue expression of the proteins and a heterogeneity score assigned, using a statistical measure of heterogeneity originally used in ecology, based on the Simpson’s biodiversity index⁷.

To date there have been no attempts to systematically map and quantify this variability in tandem with protein expression, in histological preparations. Here, we illustrate the first use of the method applied to ER and HER2 biomarker expression in ovarian cancer. Using this method paves the way for analyzing heterogeneity as an independent variable in studies of biomarker expression in translational studies, in order to establish the significance of heterogeneity in prognosis and prediction of responses to therapy.

Protocol

1. Ткань подготовки Приготовление гистологических срезов Раздел формалин фиксированных парафиновых блоков опухоли в 4 мкм толщины, используя поворотный микротоме. Место разделы на положительно заряженные микроскопические слайды. Инкубируйте слайдов в 37 ° С духовку на ночь. Хранение Магазин разделы -18 ° C до -25 ° C морозильника, для того, чтобы предотвратить потерю антигенности. 2. Иммунофлуоресценции тканевых срезов Депарафинизации и регидратации DEWAX слайды в ксилоле два раза в течение 5 мин. Увлажняет слайды в 99%, 99%, 80%, 50% этанола и струей воды в течение 2 мин каждого из них в порядке. Антиген поиска Выполните тепла индуцированных поиска антигена, с использованием 0,15 мМ цитрат натрия, рН 6,0 буфером в скороварке в течение 5 мин в мимикроволновых. Охладить слайды в течение 20 мин. Промыть слайдов в 0,05% PBST в течение 5 мин на рокера. Блокировка процедуры Лечить секций в 3% перекиси водорода в течение 10 мин. Промыть слайдов в 0,05% PBST в течение 5 мин на рокера. Добавить разделах ломать Иммуноокрашивание Sequenza. Лечить разделы в сыворотке свободного блока белка в течение 10 мин. Первичная инкубации антитела Инкубируйте Первичные антитела, разбавляют до оптимального разведения в разбавителе антитела Dako в течение 1 часа при комнатной температуре. Полоскание в 0,05% PBST три раза в течение 5 минут каждый. Эпителиальные маски (цитокератин) инкубационный Инкубируйте мыши анти-пан цитокератин, разбавленный 1:50 в разбавителе антитела Dako ночи при 4 ° C. Эпителиальные визуализации маски Подготовка 1:25 разбавление антимышиного Alexa555 свторичный антител в предварительно разбавленный Представьте коза-кролик HRP раствор антител. Инкубируйте слайдов в темноте в течение 1,5 часов при комнатной температуре. Полоскание в 0,05% PBST три раза за 5 минут каждый. Целевая визуализация Передача слайдов из Sequenza в камере влажности. Комбинат Целевая усиления сигнала растворителя (HistoRx ванны E) и Cy5 Tyramide (HistoRx трубки F) в 1:50 концентрации. Vortex, чтобы тщательно перемешать. Инкубируйте слайдов в темноте в течение 10 мин при комнатной температуре. Полоскание в 0,05% PBST три раза в течение 5 минут каждый. Дегидрировать слайдов в 80% этаноле в течение 1 мин. Воздух сухой слайдов в темноте. Counterstaining и coverslipping Применить DAPI монтажа среды на покровные и место покровные более срезах тканей. Сухой слайды на ночь в темноте. После слайды высохли, безопасный с лаком для ногтей, чтобы ануверен, долгосрочного хранения и хранить в холодильнике 4 ° C. 3. Захват изображения использованием сканирования всего раздела Нагрузка до пяти слайдов в слайд кассету Aperio ScanScope сканер слайдов FL. Для каждого слайда, выберите общую региона изображение с помощью интерфейса консоли ScanScope. Выберите регион, чтобы охватить все ткани на слайд, независимо от окраски картины или другие наблюдаемые аспекты образца. Использование ScanScope консоли для каждого канала (DAPI, Cy3 и Cy5) определить оптимальную экспозицию следующим образом: Выберите регион ткани допросить – эта область должна в идеале быть в опухолевых тканях области для обеспечения наилучшего представления. Использование автоэкспозиции функция ScanScope консоль, оценивать время экспозиции предложили для каждого канала, а также фокус изображения. Повторите в течение до 3-5 регионах каждый образец к сотрудничествуnfirm стабильность стоимости. Выберите дополнительные области (как показано на голубой бриллиант на изображение консоли ScanScope) от ткани, но все еще в пределах coverslipped области слайда, для определения фона области, где плоские изображения коррекции поле будет приобретать для каждого фильтра. Обзор этих изображений до получения изображений. Если изображение по-видимому, высокий фон или другие артефакты изображения, изображение региона должны быть перенесены и новых изображений, полученных. Приобрел цифровых изображений слайд загружаются автоматически в базу данных Спектр Aperio. 4. AQUA автоматизированного анализа изображений Просмотр цифровых изображений слайд целом в спектре базу данных и делать аннотации к опухоли областях, представляющих интерес в контексте всей ткани и окрашивание (рисунков). Выберите слайд, чтобы проанализировать использование AQUAnalysis из цифровых слайдов в списке Спектр базе данных, дважды щелкнув пальцемгвоздь изображения (в качестве альтернативы, установите флажок рядом с изображением, и выберите "Просмотр снимков» из меню в верхней части списка). Это автоматически открывает программное обеспечение ImageScope и цвет объединены образ образец ткани. Используйте это программное обеспечение для навигации изображения с помощью инструментов, предоставляемых. Использование сопровождающих H & E (либо физической слайд или аннотированные изображения), аннотировать область интереса на флуоресцентные изображения. Несколько областей интереса, индивидуальных кружил областях, можно выбрать на одном образце. Существует также "негативным" инструмент, который используется для исключения районы в пределах выбранного региона (например, поврежденной ткани, районах с плохими гистологии, неопухолевой областях, мусора и т.д.). Сохранить слой аннотаций (ы) на изображении. Вернуться в спектре главного меню и установите флажок рядом с изображением, который был только комментариями. Выберите 'Анализ' в меню полоса в верхней части списка. В анализ окно, которое появится, селенидыКТ "HistoRx AQUA анализ" из выпадающего меню. Если Есть несколько уровней аннотации, используйте флажки для выбора соответствующего уровня (ы) для анализа. Пресса "Проанализировать" кнопку, когда приступать к работе. На данный момент, сведены к минимуму окно консоли будет отображаться в панели задач Windows. Это будет отображать ход передачи изображений от спектра базу данных для локального ПК ('тянуть' операции). Как только данные переданы, AQUAnalysis начнет. Затем пользователь может использовать все внутренние функции программного обеспечения для просмотра, навигации и анализа изображений. Аннотированный области изображения из базы данных Спектр разбивается на плитки 512×512 пиксела изображения – каждая из которых будет забито в индивидуальном порядке. Для этого исследования, неконтролируемые забил AQUA алгоритм, основанный на данных, кластеризации, было использовано 8. В этом алгоритме, AQUA оценки формируются следующим образом: Пан-цитокератин изображение сигнал является thresholded выше фона, и те пиксели используются для определения опухоли "Маска", который затем используется для последующих расчетов. Высоким выражением пан-цитокератин пикселей также определить цитоплазматические / неядерных регионов опухолевых клеток. Пиксели с высоким отношением сигнал в канале DAPI, которые находятся в опухоли маски определяются как ядерное по своей природе. Алгоритм кластеризации также рассматриваются пикселей, которые имеют низкую интенсивность либо DAPI окрашивание или цитокератин выражение и пытается частично отнести их ни к ядерной или цитоплазматической отсеков, или фона. Как только все пиксели отнесены к одной из отсеков опухоли или фон, интенсивность сигнала от целевого белка (ER или HER2) рассчитывается в каждом из отсеков и нормированной на размер отсеков, производя таким образом AQUA баллов. Изображения, которые не имели достаточного представления опухоли не забил (как это определено теми, с лесс чем на 5% пикселов представляющих опухоли). Эти области также производят значение "Конечный результат" называется "Fail» и таким образом могут быть удалены в последующих статистического анализа. Кроме того, если после рассмотрения, оператора определены поля, которые не были пригодны для озвучивания из-за образец или изображений артефактов (например, сложенную ткань, мусор), эти поля были отредактированы из счета и производится «Конечный результат» называется «Fail». Результаты забил AQUA являются таблицы оценки, связанные с каждым 512×512 пикселей плитки в регионе интересов в рамках всей выборки срез ткани. Эти файлы в формате. CSV, затем могут быть использованы для последующего статистического анализа. 5. Статистический анализ: Все статистические анализы выполняются в SPSS (IBM) Где это возможно, для больших операций, генерировать SPSS синтаксис кода файлов (. SPS) для выполнения манипуляции с данными и анализом шагов. Пример синтаксиса кода предоставляется в качестве дополнительного файлов. <li> Читать файлы данных в SPSS. Удаление неиспользуемых переменных в исходных данных (например, инструмент специфические параметры, AQUA баллов от неиспользуемых отсеков). Где регионы "Конечный результат" из "Fail» (см. выше), отмечают эти значения как SYSMIS, которая выводит их из численного анализа. Совокупный всех данных для всех слайдов для каждого маркера (ER или HER2) в единый набор основных данных в формате SPSS. Используйте этот мастер-файл для всех последующих расчетов. Использование файла синтаксиса SPSS (по одному для каждого маркера: ER или HER2 (см. файлы дополнительный синтаксис) данных была дополнительно подтверждена и указатели Симпсона разнообразия рассчитывается следующим образом: Создание мастер аналитического файла, для того, чтобы предотвратить изменение основных данных набора ранее созданного. Проверка основных данных на фоне исходных данных и изображений генерируется. Продукция сводные статистические данные по оценки AQUA для каждого образца (число полей, средний балл, средний балл, Минимальное значением баллов, максимальное количество баллов, а стандартное отклонение баллов по выборке). Проверьте случайную выборку результатов с оригинальным необработанные выходные данные файлы и против исходных данных изображения забил. Для генерации тепла изображения карты (как показано на рисунках 2 и 3): "Бен" AQUA оценка данных (с использованием функции 'Visual Биннинг "в SPSS) на восемь отдельных уровней. Для ER, ядерные оценки были использованы для лечения HER2, цитоплазматические оценки были использованы. Выведите бункеров, что каждый бен представляет равнопроцентная имеющихся случаев из всего набора данных. Использование функции SPSS "Разделить файл", так что все последующие результат будет на уровне "на слайд / образец. Участок каждого региона (соответствующие плитки 512×512) его х, у координаты и цвет значения, соответствующего бен, в которую она была выделена (см. диаграммы 2 и 3). Для создания неоднородности баллов, код был написан для создания Симпсонаиндекс разнообразия с использованием AQUA баллов. Индекс Симпсона разнообразия, как он используется здесь, определяется следующим образом: Где N это общее количество баллов / полей, используемых для данного образца и п количество баллов / полей в данной группе стандартизированной оценки (производится, как описано ниже). Используйте мастер аналитического файл, описанный выше в качестве источника данных. В примерах показано, все ER расчетов использовались ядерные оценка AQUA и HER2 расчетов использовались цитоплазматических оценка AQUA. Выполнить расчеты ниже для каждого образца / слайд. С флуоресценции данные могут быть отклонения нестабильности, так, что величина ошибки распространяется с интенсивностью, применяют логарифмические (основание 2) нормализация всех AQUA баллов. Дальнейшие преобразования нормализованных (журнал преобразованных) данных в Z-(стандарт) баллов. Z-счет преобразования вычисляетсяS следующим образом: Z = (AQUA оценка – среднее значение всех баллов по выборке) / стандартное отклонение оценки по выборке. Это означает распределение оценок в распределении отклонений вокруг центрального нулевое значение отклонения. Бен этих Z-оценка значений на шесть групп (<-2, -2 – -1, -1 – 0, 0 – 1, 1 – 2,> 2). Рассчитать количество значений выделено в каждой ячейки и сумму для каждой ячейки. Используйте это значение, а также общее количество полей, для вычисления значения для каждого из шести бункеров для индекса. Сумма этих значений и вычесть из одного производить индекс разнообразия. Индекс разнообразия обеспечивает показатель оценки распространения по всему означает для конкретного образца. Таким образом, более высокие показатели указывают на более широкую распространение баллов, или увеличение гетерогенности выражения. И наоборот, более низкие показатели, свидетельствуют меньше вариаций в выражении измерения и однородные выражения в образце. Это показано в Figurэс 2 и 3. 6. Представитель Результаты: Целевые терапии с относительно низкой токсичности вещества, такие как тамоксифен и трастузумаба, не являются стандартом лечения для больных раком яичников. Существует хорошее доказательство того, что платина-таксана химиотерапии первой линии превосходит другие режимы химиотерапии рака яичников 9-13, и в то время 70-80% больных первоначально реагировать, большинство будет рецидив и умирают от своей болезни. Измерение биомаркеров, которые могут предсказать ответ на альтернативные методы лечения будут полезны при выборе индивидуальной терапии для каждого пациента, а так как химиотерапия оказывает давление отбора на опухоль, выжившие опухолевые клетки могут иметь различные характеристики и представляют субпопуляции опухоли до начала терапии; количественной этом изменения могут быть полезны. Мы применили наш неоднородность отображение подход к выражению ER и HER2 при раке яичников образцов до и после химиотерапии, в Ордет для измерения количественных изменений в выражении, а также оценить взаимосвязь между выражением биомаркеров до и после терапии. Оба ER и HER2 продемонстрировать выраженной гетерогенности в рамках отдельных опухолей, а в некоторых опухолях, Симпсона индекс изменения после терапии с относительно высокой неоднородностью по низкой неоднородности, в лице снижения Симпсона индекс оценки (см. рисунки 2 и 3). Это подтверждает мнение, что клональной селекции происходит в ответ на химиотерапии, что еще более важно, это может быть использовано использованием таргетной терапии против остаточной населения, с тем чтобы лучше персонализировать терапию для больных раком. Рисунок 1. Гематоксилин-эозином окрашенных микрофотографии различных областях одного и того же рака яичников показывает переменная морфологии. (А) x40 микрофотографии показаны две смежные области опухоли с различной морфологией. Высокая просмотра мощность (x200) выявить клетки с цитоплазматическими очистки и твердых модель роста в верхней части опухоли (Б), в то время как нижняя часть ткани (С) имеет более однородную эозинофильной цитоплазмой и папиллярного узора роста. Эта опухоль, однако, быть классифицированы как папиллярный серозный гистологический подтип для целей дальнейшего управления. Рисунок 2. Неоднородность heatmaps ЭР экспрессии белка цитокератин-положительных ткани рака яичников, до (вверху) и после (нижняя панель) терапии. Рисунок 3. Гетерогенность heatmaps HER2-экспрессии белка цитокератин-положительных ткани рака яичников, до (вверху) и после (нижняя панель) терапии.

Discussion

Метод, описанный здесь позволяет количественного молекулярной гетерогенности в стандартных фиксированных формалином, парафин гистологических участков опухоли материала. Метод позволяет значения, которая будет присвоена степень гетерогенности в срез ткани, так что это может быть принято во внимание в качестве переменной в развитии биомаркеров и анализа. Хотя в целом желательно, чтобы ткань биомаркерами являются однородными по отношению к выражению, таким образом, чтобы анализ менее восприимчив к ошибка выборки или предвзятости, она может при определенных обстоятельствах быть полезным для количественного гетерогенности в качестве параметра. Например, как показано на иллюстративный пример для ER и HER2, общие биомаркеров показывают значительную неоднородность выражения и в настоящее время неизвестно, будет ли это представляет независимое прогностическое или прогностическим фактором в отношении клинического исхода или ответа на терапию, соответственно. Аналогичным образом, как показано на рисунке, терапия сама по себе может динамически изменятьучредительные популяций клеток и, следовательно, измерение целевых обогащения могут быть полезны для определения решения о лечении.

Тем не менее, техника ограничена теми же факторами, которые ограничивают традиционные гистопатологических или биомаркеров (например, иммуногистохимического) анализы. Результат зависит от типа, размера и качества ткани анализируются, и поэтому один раздел ткань не может быть репрезентативной для всего опухоли. Действительно, индекс Симпсона может быть излишне предвзято по размеру ткани (количество кадров в плен и AQUA оценки измеряется). Иммуногенность эпитопов измеряется может быть сопряжено с неконтролируемым предварительно аналитических факторов, которые artifactually изменить их выражение через срез ткани (например, холодное время ишемии, или длина фиксации, и края артефакт). Особенно это проблема для фосфорно-эпитопы, которые, как известно, ^{14 лабильной, 15.} Поэтому методика может быть лучше подходятк резекции образцов, а не небольшой биопсии, и осуществляется на несколько разделов, а не только один. В конечном итоге, 3D методов визуализации может предложить возможность более точной количественной оценки этого параметра.

Техники, представленные также может быть ограничена с помощью биологических факторов, таких как различия в выражении эпитопа маскировки цитокератин. Это может иметь особое значение в тех рака, включая рак яичников и рак молочной железы, которые подвергаются эпителия к мезенхимальных перехода (EMT) или обогащенные для неэпителиальных компонентов или стволовых клеток ^16, как недавно было показано, что происходит в химиотерапии лечение рака яичников в пробирке ^{17 лет} и больных раком молочной железы в ответ на терапию ^18. Это ограничение может быть преодолено с помощью альтернативных антител маскировки (или коктейли антител), такие как цитокератин плюс виментин, который upregulated в EMT ^16. Кроме того, с другими компонентами ткани (микрофонroenvironment), такие как фибробласты и клетки эндотелия сосудов все чаще становятся мишенью биологической терапии, метод может быть также расширена, чтобы выиграть эти компоненты, используя специфические маски для отделения интерес, таких как PECAM / CD31 для окрашивания для сосудистых эндотелиальных клеток .

Хотя адаптация индекс Симпсона была использована в качестве меры неоднородности в текущий протокол из-за своей простоты, другие меры неоднородности могут быть использованы, например, простые измерения центральной тенденции (среднее, дисперсия, медиана, и т.д.). Кроме того, расчеты Симпсона индекс может быть изменен, чтобы лучше соответствовать конкретной популяции тест. Использование Z-оценка преобразований позволяет забил быть более применимо для нескольких маркеров с неоднородностью основана на отклонение от среднего для набора данных. Тем не менее, общий диапазон скоринга может быть ограничен в такого рода трансформацию. Некоторые проекты могут лучше подходитьпросто бен фактической оценки AQUA для всех образцов определенный набор маркеров. Выбор числа бункеров и отключений также ограничение в диапазон значений, которые могут привести и может быть оптимизирован для альтернативных экспериментальных конструкций.

Мы использовали ER и HER2 в настоящем исследовании в качестве кандидата биомаркеров, так как они уже используются в клинике, помочь ответить на соответствующие клинические вопросы в отношении эффективности таргетной терапии, а, как известно, проявлять значительную неоднородность и изменения в системе начального и далекие болезни ^19. Тем не менее, оптимальным маркером гетерогенности еще предстоит определить. Другие возможности могут включать в себя цитогенетических маркеров клональности, например, тех, которые ранее использовались в интерфазе исследования FISH ^20. Подход требует дальнейшей проверки в крупных, хорошо аннотированный клинических когорты или клинических испытаний с целью дальнейшего создания значимость этого параметра в биологии рака.

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments
ScanScope FL	Aperio	ScanScope FL	Used as equipped from vendor
Spectrum	Aperio	Spectrum	Configuration and catalog numbers will vary on how local institutions set up their database and IT structure.
AQUAnalysis, in conjunction with AQUAjustment	HistoRx	V2.3	The AQUAjustment package allows AQUAnalysis to use images stored in Spectrum.
HER2	Dako	A0485	1 in 400 dilution
mouse anti-pan cytokeratin	Dako	M3515	1 in 50 dilution
Antibody diluent	Dako	S0809
Envision goat-rabbit HRP	Dako	K4003
Protein block	Dako	X0909
Goat anti-mouse Alexa555	Invitrogen	A21422
DAPI mounting medium	Invitrogen	P36931
Cy5 Tyramide	HistoRx	AQ-EMR1-00001
Sequenza Immunostaining Center	Thermo Scientific Shandon	73300001	Used here for bench-top immunofluorescence staining