Culture Slice organotipica del mesencefalo ventrale embrionali: un sistema per studiare dopaminergici sviluppo neuronale In vitro</em
Summary
Un metodo per generare fette organotipica dal mesencefalo murino embrionale E12.5 è descritto. Le culture fetta organotipica può essere usato per osservare il comportamento dei neuroni dopaminergici o di altri neuroni del mesencefalo ventrale.
Abstract
Il mouse è un organismo modello eccellente per studiare lo sviluppo del cervello dei mammiferi a causa della abbondanza di dati molecolari e genetici. Tuttavia, il cervello di topo in via di sviluppo non è adatto per una facile manipolazione e di imaging in vivo in quanto l'embrione del mouse è inaccessibile e opaco. Culture fetta organotipica di cervelli embrionali sono quindi ampiamente utilizzati per studiare lo sviluppo del cervello murino in vitro. Ex-vivo, la manipolazione o l'uso di topi transgenici permette la modifica dell'espressione genica in modo che le sottopopolazioni di cellule neuronali e gliali possono essere etichettati con proteine fluorescenti. Il comportamento delle cellule etichettate possono essere osservate con time-lapse imaging. Time-lapse imaging è stata particolarmente efficace per lo studio dei comportamenti delle cellule che sono alla base dello sviluppo della corteccia cerebrale a fine fase embrionale 1-2. Embrionale organotipica sistemi fetta della cultura nelle regioni del cervello al di fuori del prosencefalo sono establis menoHED. Pertanto, la ricchezza di time-lapse dati di immagini che descrivono la migrazione delle cellule neuronali è limitato al 3,4 proencefalo. Non è ancora noto, se i principi scoperti per il cervello dorsale valere per le aree del cervello ventrale. Ventrale del cervello, i neuroni sono organizzati in gruppi neuronali, piuttosto che i livelli e spesso devono sottoporsi a complicate traiettorie migratorie per raggiungere la loro posizione finale. Il mesencefalo ventrale non è solo un buon sistema modello per lo sviluppo cerebrale ventrale, ma contiene anche le popolazioni neuronali come i neuroni dopaminergici che sono rilevanti nei processi di malattia. Mentre la funzione e la degenerazione dei neuroni dopaminergici è stato studiato in grande dettaglio nel cervello adulto e l'invecchiamento, poco si sa circa il comportamento di questi neuroni durante la fase di differenziazione e migrazione 5. Descriviamo qui la generazione di culture fetta dal giorno embrionale (E) 12,5 mesencefalo ventrale del mouse. Queste fetta cultoUres siano potenzialmente idonei per il monitoraggio dello sviluppo dei neuroni dopaminergici per diversi giorni in vitro. Evidenziamo i passaggi critici nella generazione di fette di cervello in queste prime fasi di sviluppo embrionale e discutere le condizioni necessarie per mantenere il normale sviluppo dei neuroni dopaminergici in vitro. Abbiamo inoltre presentare i risultati di esperimenti di imaging lasso di tempo. In questi esperimenti, precursori mesencefalo ventrale (compresi i precursori dopaminergici) ed i loro discendenti sono stati etichettati in modo mosaico utilizzando un Cre / loxP basato destino sistema inducibile mappatura 6.
Protocol
Discussion
Il metodo organotipica cultura fetta qui presentato fornisce un sistema di breve termine in analisi in vitro di neuroni dopaminergici e sviluppare le loro rotte migratorie e di proiezione nel mesencefalo ventrale embrionale. Abbiamo scoperto che ci sono una serie di passaggi critici nel protocollo che dovrebbe essere attentamente curato in modo da ottenere fette che permettono il normale sviluppo dei neuroni dopaminergici del mesencefalo ventrale. La fase più critica è la dissezione del cervello embr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo Martine Emond e Isabel Brachmann per il loro aiuto nello stabilire la organotipica sistema cultura fetta e Wolfgang Hübner e Liviu Gabriel Bodea per la lettura critica del manoscritto. Vorremmo ringraziare Frank Costantini per la R26 topi reporter e Tabin Cliff per i topi Creer Shh. Questo studio è stato finanziato da un premio di ricerca del Ministero della Scienza e della Ricerca del Nord-Reno Westfalia (Programm zur Förderung der Rückkehr des wissenschaftlichen Spitzennachwuchses aus dem Ausland).
Materials
Table of specific reagents and equipment
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| DMEM | Sigma-Aldrich | D6429 | |
| Glucose 30% | Sigma-Aldrich | G7528-250 | |
| Horse Serum | Invitrogen | 26050-088 | |
| DMEM (4,5g/L Glc., with L-Gln, Na Pyr, NaHCO3) | Sigma-Aldrich | D6429-500 | |
| Penicillin/Streptomycin 100x | Sigma-Aldrich | P4333-20 | |
| L-ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4403 | prepare 200mM stock and store at -20°C |
| UltraPure LMP agarose | Invitrogen | 15517-022 | |
| Millicel inserts | Millipore | PICMORG50 | |
| μ-dish 35 mm, low | Ibidi | 80136 | |
| Vibratome | Microm | HM 650V | |
| Razor Blade | Plano GmbH | 121-6 | |
| Histoacryl glue | BRAU9381104 | Braun Aesculap | |
| Perforated Spoon Dia diameter 15 mm |
Fine Science Tools | 10370 -18 | |
| Forceps 5 Dumoxel | Fine Science Tools | 11252 – 30 |
Antibodies used for immunostainings:
| Name of the antibody | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Rabbit anti-tyrosine hydroxylase | Millipore | AB152 | Dilution 1:500 |
| Mouse anti-tyrosine hydroxylase | Millipore | MAB318 | Dilution 1:500 |
| Mouse anti-BrdU | BD Pharmingen | 555627 | Dilution 1:200 |
| Rabbit anti-cleaved caspase 3 | Cell Signaling Technology | 9661 | Dilution 1:200 |
| Donkey anti-rabbit IgG-Alexa 488 | Invitrogen | A21206 | Dilution 1:500 |
| Donkey anti-mouse IgG-Cy3 | Jackson ImmunoResearch | 715-165-150 | Dilution 1:200 |
References
- Noctor, S. C., Martinez-Cerdeno, V., Ivic, L., Kriegstein, A. R. Cortical neurons arise in symmetric and asymmetric division zones and migrate through specific phases. Nat. Neurosci. 7 (2), 136-136 (2004).
- Martini, F. J. Biased selection of leading process branches mediates chemotaxis during tangential neuronal migration. Development. 136 (1), 41-41 (2009).
- Marin, O., Valiente, M., Ge, X., Tsai, L. H. Guiding neuronal cell migrations. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 2 (2), a001834-a001834 (2010).
- Ayala, R., Shu, T., Tsai, L. H. Trekking across the brain: the journey of neuronal migration. Cell. 128 (1), 29-29 (2007).
- Smidt, M. P., Burbach, J. P. How to make a mesodiencephalic dopaminergic neuron. Nat. Rev. Neurosci. 8 (1), 21-21 (2007).
- Legue, E., Joyner, A. L. Genetic fate mapping using site-specific recombinases. Methods. Enzymol. 477, 153-153 (2010).
- Daza, R. A., Englund, C., Hevner, R. F. Organotypic slice culture of embryonic brain tissue. CSH Protoc. , (2007).
- Harfe, B. D. Evidence for an expansion-based temporal Shh gradient in specifying vertebrate digit identities. Cell. 118 (4), 517-517 (2004).
- Srinivas, S. Cre reporter strains produced by targeted insertion of EYFP and ECFP into the ROSA26 locus. BMC Dev. Biol. 1, 4-4 (2001).
- Joksimovic, M. Spatiotemporally separable Shh domains in the midbrain define distinct dopaminergic progenitor pools. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106 (45), 19185-19185 (2009).
- Blaess, S. Temporal-spatial changes in Sonic Hedgehog expression and signaling reveal different potentials of ventral mesencephalic progenitors to populate distinct ventral midbrain nuclei. Neural. Dev. 6 (1), 29-29 (2011).
- Hippenmeyer, S. A developmental switch in the response of DRG neurons to ETS transcription factor signaling. PLoS Biol. 3 (5), e159-e159 (2005).
