부품 1A. 장비 현미경 : 낮은 전력 목적으로 직립 스테레오 – 해부 범위 전압 / 펄스 발생기 : BTX ECM 830 스퀘어 웨이브 Electroporation 시스템 피펫 풀러 : P – 87 Micropipette 풀러 (셔터 악기 회사, CA) 속이는 사람 : 거친, 또는 결합 굵고 좋은가 준비에 따라 다릅니다. Micropipette 홀더 : 파인 과학 도구 전극 : 수제 Electroporation 챔버 : 수제 L – 모양의 전극 : 고순도의 8cm 0.4 mm의 텅스텐 와이어 (Goodfellow)과 midpoint에 부착을 잘라 접착제를 (우리가 블루 – 압정을 사용)를 사용하여 1ml 주사기. L – 모양에 주사기 및 굽힘 팁의 끝부분에서 노출된 4cm의 텅스텐 와이어를 떠나 끝에서 1cm (그림 1A). 팁 이렇게 끝이 길이가 0.5 mm를 측정하는 것을 낸다. 티그의 끝은 전극 종착역입니다. 주사기에 여분의 텅스텐 와이어 병렬를 실행하고 전극 펄스 발생기를 연결하는 그것을 사용합니다. 전극 한 켤레를 만드는 과정을 반복합니다. DC 케이블을 통해 사각형 웨이브 펄스 발생기에 전극을 부착합니다. Electroporation 챔버 ~ 5mm 무독성 플라스티신와 90mm 접시의 바닥 선. electroporation 미디어와 함께 요리를 입력합니다. 사용 5 호 시계 제조인의 집게는 T – 모양 잘 (그림 2) 싶습니다. 오랜 우물 ~ 2mm X 2mm X 10mm와 짧은을 ~ 2mm X 2mm X 5mm를 측정한다. electroporation 요리 세탁해서 활용할 수 있습니다. 부품 1B. 시약 DNA 또는 유료 macromolecules Micropipettes : 1mm 폭 4 "길이 borosilicate 유리 모세관 (WPI, TW100 – F) 문화 미디어 : 일반 수륙 양용 미디어 (NAM) > 10 X 재고 : 1100 MM NaCl, 20MM KCL, 10 MM 칼슘 (NO 3) 2 • 4H 2 O, 1 ㎜ EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산). 4 ° C.에 압력솥 및 저장 1 X NAM : 0.1 MM NaHCo 3 0.2 MM 나 3 PO 4 10X 주식, 버퍼에서 희석. Xenopus laevis tadpoles, 단계 28 DNA 준비 : 표준 프로토콜을 사용하여 표현 plasmids를 준비합니다. nuclease 무료로 H 2 0 1 μg / μl의 최종 농도로 DNA를 Resuspend. * 우리는 같은 pCS2로 강한 CMV 프로 모터를 포함하는 벡터, 성공 있었 + [16]. 혈통 분석을 위해, 우리는 대개 0.1 μg / μl의 최종 농도에서 녹색 형광 단백질 (GFP pCS2 +)를 인코딩 DNA를 포함합니다. 0.1-3 μg / μl 사이 [DNA의 농도도 테스트했다. 우리는 발견 0.8 μg / μl inefficiently 표시 셀 아래의 농도, DNA의 농도 반면 이상 2 μg / & MU; 난 electroporation 효율을 향상되지 않았]. Morpholino oligonucleotide 준비 : (참고 :. 수법의 살인인 걸 fluoresceinated해야합니다 (3' – carboxyfluorescein 수정)하거나 유료) Resuspend morpholino의 oligonucleotides (수법의 살인인) (Genetools, www.genetools.com nuclease 무료로 H 2 0 2 mm의 농도에서). 65 재고 솔루션의 열 나누어지는 ° C 5 분. nuclease 무료 물에 0.5 mm의 최종 농도 희석. * 0.1 – 1mM MO 솔루션은 테스트되었습니다. 0.5 MM MO 솔루션은 많은 mesenchymal 세포 electroporation에 충분했다. Micropipettes borosilicate 유리 모세관 (폭 1mm, 4 "긴 WPI 안돼. TW100 – F)에서 micropipettes를 준비합니다. 8-12밀리미터 긴 테이퍼 및 고급 팁과 micropipettes를 준비하는 바늘 풀러를 사용합니다. 호감 팁 ~ 2mm팁에서 집게를 사용하여 톱니 휴식을 만들 수 있습니다. 미디어 부화 미디어 : 1X 주식 신선한 4분의 3 일반 수륙 양용 미디어 (NAM)를 준비합니다. 0.025 MG / ML gentamycin을 추가합니다. Electroporation 미디어 : 위에서와 0.1 % Benzocaine (시그마, 06950). 2. Electroporation Micropipette 설정 ~ 1 μl 주입 솔루션 micropipette를 입력합니다. micromanipulator에 micropipette를 확보하고 microinjector (Picospritzer II)에 첨부해 주시기 바랍니다. 탁상에서 50 °의 각도 micropipette. 20 PSI로 분사 압력을 설정합니다. 펄스 30 NL를 삽입하는 micropipette를 보정합니다. 올챙이 준비 5 분 electroporation 매체의 잠복기에 의해 무대 28 Xenopus의 애벌레를 마취. electroporation 미디어 가득 electroporation 챔버에 anesthetized 올챙이를 전송합니다. 위치 배아긴 시간 잘 수 있도록 머리를 아래 지느러미 측면과 노출된 복부 측면과 함께 T – 교차점에 달려 것을. 머리는 약간 꼬리에 비해 상승한다. 집게를 사용하면, 부드럽게 플라스티신 주변과 잘에서 올챙이을 확보. (참고 :.. 올챙이가 보안되지 않은 경우, 그것이 떨리는와 electroporation 동안 전극 연락을 얼굴 조직이 심각하게 손상될 수 있으므로이 경우에는 올챙이를 삭제 수 있습니다) Electroporation micropipette 팁 즉시 시멘트 선에 후부와 얼굴 mesenchyme에 넣습니다. mesenchyme로 30 NL 솔루션을 주사. micropipette를 철회. 빠르게 배아의 머리 (그림 3) 병렬 전극 팁에 맞춥니다. 8 50 MS, 20mV 사각형 펄스를 적용합니다. 전극을 철회. 집게를 이용하는 것은 신중하게 우물에서 올챙이 릴리스 3 / 4 NAM, 0.025 MG / ML gentamycin을 전송. Tadpoles는 NAM, 0.025 MG / ML overn 4분의 3에 incubated 수 있습니다항공, 이상. 24 시간 후에 형광 현미경에 의한 효율적인 electroporation을위한 화면 배아. 3. 대표 결과 : 형광 분자의 사용은 electroporated 배아 쉽게 검사 수 있습니다. 그림 4는 14.5에서 incubated MO electroporated tadpoles ~ 12, 48 electroporation 후 96시간의 전형적인 배치, ° C.를 보여줍니다 형광 현미경을 사용하여 수법의 살인인 즉시 electroporation 후 시각과 electroporation 후 며칠 동안 계속하실 수 있습니다. 우리의 경험에서 형광 무대 46 (~ 5 일 후)에 약하게 분명하다. 연골에는 형광은 차별화 (~ 스트리트 42)의 발병 이후 크게 감소하지만, MO 형광는 pharyngeal endoderm 등 다른 세포 유형에 더 강력하게 지속. 형광 현미경은 oligonucleotides는 연골 등 여러 craniofacial 조직에 통합됩니다 것을 보여줍니다. Oligonucleotide 형광 C은 종종 머리 양쪽에 조직에서 시각 수 있습니다. 이것은 가능성이 electroporation하기 전에 느슨한 craniofacial mesenchyme 내내 사출 솔루션의 빠른 확산에 의한 것입니다. 1 집에서 만든 전극을 그림. L – 모양의 텅스텐 와이어는 무독성 점토 또는 퍼티를 사용하여 1 ML의 주사기에 첨부되어 있습니다. (A) 전극 말단은 5mm를 측정합니다. (B) 테르 병렬 실행 등, 전극의 쌍을 연결합니다. 전극 DC 케이블에 의해 펄스 발생기에 연결된 있습니다. 이 Electroporation 챔버 그림. (A) 플라스티신 줄지어 90mm 요리는 미디어와 시계 제조인 없음 5의 집게와 함께 새겨진 T – 모양의 챔버로 가득합니다. (B) 긴 쪽을 2mm X 2mm에게 X10 mm를 측정짧은 조치 2mm X 2mm X 5mm를 하다니. 배아의 머리가 T – 접합, 복부 측면에 달려있다. 3 도식 보여주 electroporation 절차를 그림. 성 28 올챙이는 복부 측면은 최고, electroporation 챔버에 배치됩니다. Micropipette는 얼굴 mesenchyme 기본 시멘트 선에 삽입됩니다. 주입. Micropipette은 제거하고 L – 모양의 전극은 병렬로 머리를 측면 정렬됩니다. 팔 50 MS, 20 MV 사각형 펄스를 적용합니다. 전극을 철회. 원하는 단계로 tadpoles 성장. 수법의 살인인 또는 형광 현미경을 사용하여 GFP 발현을 Visualise. 사 대표 tadpoles 12 (A), 48 (B) 및 96 (C) 시간 게시 electroporation을 (단계 30, 34 각각 44) 그림. ( "- B") 형광등 MO는 사슴에 craniofacial mesenchyme 내에서 시각 수 있습니다초밖에 30 34. 형광은 스테이지 44 (화살촉, C' – C ")에 연골에서 발견하실 수 있습니다. 창자는 매우 autofluorescent입니다.