리프트 밸리 열병 바이러스 백신 안전 및 효능을 향상하기 위해 MP - 12 스트레인의 NSS 진을 조작하는 역방향 유전자를 사용하여
Summary
리프트 밸리 열병 바이러스 MP – 12 백신 스트레인에 대한 역방향 유전 시스템은 증가 감쇄 및 immunogenicity로 추가 MP – 12 돌연변를 만들기위한 유용한 도구입니다. 우리는 NSS 돌연변이 변종을 생성하고 특성화 프로토콜을 설명합니다.
Abstract
출혈성 발열, 신경 장애 또는 인간의 실명 및 고속 낙태와 ruminants 1 태아의보기 흉한 것의 원인이 리프트 밸리 열병 바이러스 (RVFV)는, 선택한 에이전트 및 위험 그룹 3 병원체를 중복 HHS / USDA으로 분류되었습니다. 그것은 가족 Bunyaviridae에 속 Phlebovirus에 속한이 가족의 가장 악성 멤버 중 하나입니다. RVFV MP – 12 백신 스트레인 2,3뿐만 아니라 ZH548 및 ZH501를 포함한 야생 형 RVFV의 변종 4-6에 대한 몇 가지 역방향 유전 시스템은 2006 년부터 개발되었습니다. MP – 12 변형은 (위험 그룹 2 병원체가 아닌 선택 대리인되는) 몇몇은의 돌연변이 M과 L – 세그먼트로 높은 감쇠 있지만, 여전히 기능 독기를 인코딩 악성 S – 세그먼트 RNA 3, 운반 요소, NSS. 그것으로 effic 복제하면서 rMP12 – C13type (C13type)는 NSS ORF의 삭제 – 프레임의 69 % 나르는 것은, 모든 알려진 NSS 기능을 결여ient는 VeroE6 세포의 MP – 12 타입 – I IFN에 부족 않습니다. NSS는 인터페론 (IFN) – 베타 mRNA 7,8를 포함하여 호스트 전사의 종료 – 오프를 유도하고 사후 translational 수준에서 두 번 좌초 RNA – 의존 단백질 키나제 (PKR)의 저하를 추진하고 있습니다. 9,10 IFN – 베타 transcriptionally입니다 인터페론 규제 요인 3 (IRF – 3), NF – KB 및 활성 단백질 1 (AP – 1) 및 IFN-alpha/beta 수용체에 IFN – 베타의 바인딩 (IFNAR)에 의해 upregulated는 IFN – 알파의 전사를 촉진 NSS에 의한 IFN – 베타 유전자를 포함하여 호스트 전사 억제 바이러스는 복제에 대한 응답으로 그 ISGs의 유전자 upregulations을 방지 반면, 호스트 항바이러스 활동을 유도 유전자 또는 다른 인터페론 자극 유전자 (ISGs) 11, 비록 IRF – 3, NF – KB와 활성제 단백질 1 (AP – 1) RVFV7에 의해 활성화될 수 있습니다. . 따라서, NSS 추가 MP – 12을 자제하고, IFN – 베타 억제 기능을 폐지하여 호스트 타고난 면역 반응을 향상시킬 수있는 좋은 대상입니다. 여기에우리는 재조합 MP – 12 인코딩 변이된 NSS 창출을위한 프로토콜을 설명하고, IFN – 베타 mRNA 합성을 억제하는 기능을 부족한 NSS 돌연변이를 확인하기 위해 검사 방법의 예를 제공합니다. 타고난 면역에 그 본질적인 역할뿐만 아니라, 입력 – I IFN이 돌기 세포 및 적응 면역 반응의 유도 12-14의 성숙을 위해 중요합니다. 따라서, NSS의 돌연변이 타입 – I IFN을 유도하는 것이 더 감쇠 있지만, 동시에 접종 방식에 적합하게 후보자 야생 형 MP – 12보다 자극 호스트 면역 반응에 더 효율적입니다.
Protocol
Discussion
RVFV에 대한 유전학 시스템을 리버스는 T7 프로 모터 2,4,5 드나 마우스 3 인간 4 POL – I 프로 모터를 이용하여 여러 그룹에 의해 개발되었습니다. 이 원고에서는, 우리는 BHK/T7-9 세포 15되는 안정 표현 T7 RNA 효소를 사용하여 재조합 RVFV MP – 12 계통을 생성하는 프로토콜을 설명합니다. 바이러스 복구의 효율 BHK/T7-9 세포의 상태에 따라 다양, plasmids의 양을, transfected 세포 ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 부여 5 번 우수 서양 지역 센터 (WRCE)를 통해 U54 AI057156 – 07, 알레르기 및 전염병 국립 연구소에서 1 R01 AI08764301 – A1, 그리고 대학에서 백신 개발을위한 Sealy 센터에서 내부 자금으로 투자되었다 텍사스 의료 지점.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Minimum Essential Medium (MEM)-alpha | Invitrogen | 32561037 | |
| Dulbecco’s modified minimum essential medium | Invitrogen | 11965092 | |
| Modified Eagle Medium (MEM 2x) | Invitrogen | 11935046 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140122 | |
| Hygromycin B | Cellgro | 30-240-CR | |
| Tryptose phosphate broth | MP biomedicals | 1682149 | |
| Noble agar | VWR | 101170-362 | |
| TransIT-LT1 | Mirus | MIR2300 | |
| Opti-MEM | Invitrogen | 31985070 | |
| Aerosol tight lid | Eppendorf | C-2223-25 | |
| 0.33% neutral red solution | Sigma Aldrich | N2889-100ML | |
| C57/WT MEF cells | InvivoGen | mef-c57wt | |
| Blasticidin S | InvivoGen | Ant-bl-1 | |
| Zeocin | InvivoGen | ant-zn-1 | |
| QUANTI-Blue | InvivoGen | rep-qb1 | |
| BHK/T7-9 cells15 | Gifu university, Japan | ||
| Vero E6 cells | ATCC | CRL-1586 |
References
- Bird, B. H., Ksiazek, T. G., Nichol, S. T., Maclachlan, N. J. Rift Valley fever virus. J. Am. Vet. Med. Assoc. 234, 883-893 (2009).
- Ikegami, T., Won, S., Peters, C. J., Makino, S. Rescue of infectious rift valley fever virus entirely from cDNA, analysis of virus lacking the NSs gene, and expression of a foreign gene. J. Virol. 80, 2933-2940 (2006).
- Billecocq, A. RNA polymerase I-mediated expression of viral RNA for the rescue of infectious virulent and avirulent Rift Valley fever viruses. Virology. 378, 377-384 (2008).
- Habjan, M., Penski, N., Spiegel, M., Weber, F. T7 RNA polymerase-dependent and -independent systems for cDNA-based rescue of Rift Valley fever virus. J. Gen. Virol. 89, 2157-2166 (2008).
- Gerrard, S. R., Bird, B. H., Albarino, C. G., Nichol, S. T. The NSm proteins of Rift Valley fever virus are dispensable for maturation, replication and infection. Virology. 359, 459-465 (2007).
- Billecocq, A. NSs protein of Rift Valley fever virus blocks interferon production by inhibiting host gene transcription. J. Virol. 78, 9798-9806 (2004).
- May, N. L. e. TFIIH transcription factor, a target for the Rift Valley hemorrhagic fever virus. Cell. 116, 541-550 (2004).
- Ikegami, T. Rift Valley fever virus NSs protein promotes post-transcriptional downregulation of protein kinase PKR and inhibits eIF2alpha phosphorylation. PLoS Pathog. 5, e1000287-e1000287 (2009).
- Habjan, M. NSs protein of Rift valley fever virus induces the specific degradation of the double-stranded RNA-dependent protein kinase. J. Virol. 83, 4365-4375 (2009).
- Garcia-Sastre, A., Biron, C. A. Type 1 interferons and the virus-host relationship: a lesson in detente. Science. 312, 879-882 (2006).
- Bon, A. L. e. Type i interferons potently enhance humoral immunity and can promote isotype switching by stimulating dendritic cells in vivo. Immunity. 14, 461-470 (2001).
- Le Bon, A., Tough, D. F. Links between innate and adaptive immunity via type I interferon. Curr. Opin. Immunol. 14, 432-436 (2002).
- Tough, D. F. Type I interferon as a link between innate and adaptive immunity through dendritic cell stimulation. Leuk. Lymphoma. 45, 257-264 (2004).
- Ito, N. Improved recovery of rabies virus from cloned cDNA using a vaccinia virus-free reverse genetics system. Microbiol. Immunol. 47, 613-617 (2003).
- Terasaki, K., Murakami, S., Lokugamage, K. G., Makino, S. Mechanism of tripartite RNA genome packaging in Rift Valley fever virus. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 804-809 (2010).
- Buchholz, U. J., Finke, S., Conzelmann, K. K. Generation of bovine respiratory syncytial virus (BRSV) from cDNA: BRSV NS2 is not essential for virus replication in tissue culture, and the human RSV leader region acts as a functional BRSV genome promoter. J. Virol. 73, 251-259 (1999).
- Diaz, M. O. Homozygous deletion of the alpha- and beta 1-interferon genes in human leukemia and derived cell lines. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85, 5259-5263 (1988).
- Mosca, J. D., Pitha, P. M. Transcriptional and posttranscriptional regulation of exogenous human beta interferon gene in simian cells defective in interferon synthesis. Mol. Cell. Biol. 6, 2279-2283 (1986).
- Constantinescu, S. N. Expression and signaling specificity of the IFNAR chain of the type I interferon receptor complex. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 10487-10491 (1995).
- Kumar, K. G., Tang, W., Ravindranath, A. K., Clark, W. A., Croze, E., Fuchs, S. Y. SCF(HOS) ubiquitin ligase mediates the ligand-induced down-regulation of the interferon-alpha receptor. EMBO J. 22, 5480-5490 (2003).
- Kakach, L. T., Suzich, J. A., Collett, M. S. Rift Valley fever virus M segment: phlebovirus expression strategy and protein glycosylation. Virology. 170, 505-510 (1989).
- Kakach, L. T., Wasmoen, T. L., Collett, M. S. Rift Valley fever virus M segment: use of recombinant vaccinia viruses to study Phlebovirus gene expression. J. Virol. 62, 826-833 (1988).
- Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector. Gene. 108, 193-199 (1991).
- Muller, R. Characterization of clone 13, a naturally attenuated avirulent isolate of Rift Valley fever virus, which is altered in the small segment. Am. J. Trop. Med. Hyg. 53, 405-411 (1995).
- Le May, N. A SAP30 complex inhibits IFN-beta expression in Rift Valley fever virus infected cells. PLoS Pathog. 4, e13-e13 (2008).
- Kalveram, B., Lihoradova, O., Ikegami, T. NSs Protein of Rift Valley Fever Virus Promotes Post-Translational Downregulation of the TFIIH Subunit p62. J. Virol. 85, 6234-6243 (2011).
- Taniguchi, T., Ogasawara, K., Takaoka, A., Tanaka, N. IRF family of transcription factors as regulators of host defense. Annu. Rev. Immunol. 19, 623-655 (2001).
- Marie, I., Durbin, J. E., Levy, D. E. Differential viral induction of distinct interferon-alpha genes by positive feedback through interferon regulatory factor-7. EMBO J. 17, 6660-6669 (1998).
- Ikegami, T., Won, S., Peters, C. J., Makino, S. Rift Valley fever virus NSs mRNA is transcribed from an incoming anti-viral-sense S RNA segment. J. Virol. 79, 12106-12111 (2005).
- Mims, C. A. Rift Valley Fever virus in mice. I. General features of the infection. Br. J. Exp. Pathol. 37, 99-109 (1956).
- Bouloy, M. Genetic evidence for an interferon-antagonistic function of rift valley fever virus nonstructural protein NSs. J. Virol. 75, 1371-1377 (2001).
- Bird, B. H., Albarino, C. G., Nichol, S. T. Rift Valley fever virus lacking NSm proteins retains high virulence in vivo and may provide a model of human delayed onset neurologic disease. Virology. 362, 10-15 (2007).
