स्टोर संचालित जीवित कोशिकाओं में कैल्शियम प्रविष्टि प्रतिदीप्ति आधारित मापन संवर्धित सेल कैंसर से कंकाल की मांसपेशी फाइबर

Summary

दुकान संचालित Ca की हद^{2 +} प्रविष्टि (SOCE) फ्लोरोसेंट सीए का उपयोग करते हुए नजर रखी जा सकती है^{2 +} संकेतक. Mn^{2 +} संवर्धित कोशिकाओं और कंकाल की मांसपेशी फाइबर में इस तरह के संकेतकों assays के SOCE के शमन. एक यंत्रवत् चमड़ी मांसपेशी फाइबर की confocal इमेजिंग द्वारा SOCE के स्थानिक और लौकिक संकल्प अनुमति तकनीक भी वर्णित है.

Abstract

Store operated Ca²⁺ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca²⁺ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca²⁺ into cells to replenish depleted endoplasmic reticulum (ER) or sarcoplasmic reticulum (SR) Ca²⁺ stores^1,2. Since Ca²⁺ is a ubiquitous second messenger, it is not surprising to see that SOCE plays important roles in a variety of cellular processes, including proliferation, apoptosis, gene transcription and motility. Due to its wide occurrence in nearly all cell types, including epithelial cells and skeletal muscles, this pathway has received great interest^3,4. However, the heterogeneity of SOCE characteristics in different cell types and the physiological function are still not clear^5-7.

The functional channel properties of SOCE can be revealed by patch-clamp studies, whereas a large body of knowledge about this pathway has been gained by fluorescence-based intracellular Ca²⁺ measurements because of its convenience and feasibility for high-throughput screening. The objective of this report is to summarize a few fluorescence-based methods to measure the activation of SOCE in monolayer cells, suspended cells and muscle fibers^5,8-10. The most commonly used of these fluorescence methods is to directly monitor the dynamics of intracellular Ca²⁺ using the ratio of F_340nm and F_380nm (510 nm for emission wavelength) of the ratiometric Ca²⁺ indicator Fura-2. To isolate the activity of unidirectional SOCE from intracellular Ca²⁺ release and Ca²⁺ extrusion, a Mn²⁺ quenching assay is frequently used. Mn²⁺ is known to be able to permeate into cells via SOCE while it is impervious to the surface membrane extrusion processes or to ER uptake by Ca²⁺ pumps due to its very high affinity with Fura-2. As a result, the quenching of Fura-2 fluorescence induced by the entry of extracellular Mn²⁺ into the cells represents a measurement of activity of SOCE⁹. Ratiometric measurement and the Mn⁺² quenching assays can be performed on a cuvette-based spectrofluorometer in a cell population mode or in a microscope-based system to visualize single cells. The advantage of single cell measurements is that individual cells subjected to gene manipulations can be selected using GFP or RFP reporters, allowing studies in genetically modified or mutated cells. The spatiotemporal characteristics of SOCE in structurally specialized skeletal muscle can be achieved in skinned muscle fibers by simultaneously monitoring the fluorescence of two low affinity Ca²⁺ indicators targeted to specific compartments of the muscle fiber, such as Fluo-5N in the SR and Rhod-5N in the transverse tubules^9,11,12.

Protocol

1. 2 Ca + व्यक्ति की कोशिकाओं के लिए माप intracellular KYSE-150, एक मानव के esophageal स्क्वैमस सेल कार्सिनोमा (ECSS) सेल लाइन 5% सीओ 2 के वातावरण में 37 पर संवर्धित किया जाता है डिग्री सेल्सियस मिश्रित RPMI है 1640/Ham एफ 12 (1:1) मध्यम 5% भ्रूण गोजातीय सीरम में. KYSE कोशिकाओं 150 प्लास्मिड के साथ में ट्रांसफ़ेक्ट कर रहे हैं या तो shRNA Orai1 या तले हुए अनुक्रम के खिलाफ विशेष रूप से युक्त. प्लास्मिड भी एक पत्रकार है, जो एक अलग प्रमोटर के द्वारा संचालित है के रूप में एक जीन एन्कोडिंग लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन (आरएफपी) शामिल हैं. कोशिकाओं गिलास नीचे व्यंजन में बड़े हो रहे हैं 48 घंटे के लिए (1.5 सं कवर गिलास, MatTek, एमए). मध्यम निकालें और एक संतुलित नमक समाधान (बीएसएस) (140 मिमी NaCl, 2.8 मिमी KCl, 2 मिमी 2 CaCl, 2 मिमी 2 MgCl, 10 मिमी HEPES, 7.2 पीएच) के साथ कोशिकाओं कुल्ला. 1 मिलीलीटर बीएसएस पकवान में 2 Fura 2 acetoxymethyl एस्टर (आण्विक जांच) माइक्रोन युक्त समाधान जोड़ें और पन्नी के साथ पूरी पकवान लपेटो करने के लिए proteप्रकाश से सीटी. 37 ° सेल्सियस पर 40 मिनट के लिए कोशिकाओं को सेते हैं और फिर उन्हें एक अतिरिक्त 15 मिनट की अवधि के लिए कमरे के तापमान पर छोड़ एस्टर hydrolysis को पूरा करने की अनुमति. बीएसएस के साथ कोशिकाओं को दो बार से धो लें. Nikon के TE200 उलटा माइक्रोस्कोप, जो पीटीआई spectrofluorometer के लिए जुड़ा हुआ है, 350 और 390 और 510 एनएम एनएम उत्सर्जन में उत्तेजना तरंगदैर्य के साथ मंच पर पकवान माउंट. सटीक उत्तेजना के लिए इस्तेमाल किया जा तरंगदैर्य थोड़ा प्रत्येक व्यक्ति प्रणाली की प्रकाशिकी के आधार पर भिन्न हो सकते हैं. सबसे अच्छा गतिशील अनुपात के साथ दो तरंगदैर्य उत्तेजना 2 Ca + 0 से 39.8 माइक्रोन (या उच्च एकाग्रता में Fura – 2 प्रतिदीप्ति संतृप्त है) को लेकर युक्त समाधान में Fura-2 नमक की स्कैनिंग स्पेक्ट्रम द्वारा निर्धारित कर रहे हैं. Ca 2 (2 मिमी), EGTA (0.5 मिमी), EGTA टीजी (thapsigargin, 5 माइक्रोन), 2 Ca (SOCE अवरोध करनेवाला + 2 APB, 75 बीएसएस में 4 अलग अलग समाधान के साथ एक गुरुत्वाकर्षण छिड़काव प्रणाली सेट ) माइक्रोन. कम्प्यूटर नियंत्रित स्वचालित perfusiपर सिस्टम को भी इस्तेमाल किया जा सकता है. दृश्य मोड में आरएफपी व्यक्त कोशिकाओं का चयन करें. 10x बढ़ाई छिड़काव प्रणाली का उद्घाटन टिप स्थिति तक टिप एक 45 डिग्री के कोण पर ब्याज की क्षेत्र के ऊपर सही है. इसके साथ ही प्रतिदीप्ति एफ 390nm 350nm और एफ संकेतों रिकॉर्ड. अनुपात (एफ 390nm 350nm / एफ) तीसरे विंडो में प्रदर्शित होता है. बदलें, EGTA, Ca + 2; EGTA टीजी, Ca + 2, 2 Ca +-2-APB Ca + 2: निम्नलिखित क्रम में छिड़काव समाधान. ऊपर प्रोटोकॉल सेल निलंबन प्रणाली में intracellular क्षमताओं के 2 माप के लिए संशोधित किया जा सकता है. इसके बाद के संस्करण के रूप में एक ही संस्कृति शर्त के साथ T25 कुप्पी में संस्कृति KYSE 150 कोशिकाओं. जब कोशिकाओं को 90% संगम तक पहुँचने, मध्यम हटाने और बीएसएस समाधान के साथ कोशिकाओं कुल्ला. 2.5 मिलीलीटर बीएसएस समाधान 2 माइक्रोन Fura-2 AM और सेते हैं युक्त जोड़ें37 पर 40 मिनट के लिए कोशिकाओं डिग्री सेल्सियस deesterification द्वारा पीछा किया. बीएसएस निकालें, कुप्पी और अंडों पर बैठना में 37 डिग्री सेल्सियस तक 2.5 मिलीग्राम trypsin कोशिकाओं को अलग जोड़ने. तो 2.5 मिलीग्राम संस्कृति मध्यम जोड़ने के लिए रोक trypsinization और centrifugation द्वारा कोशिकाओं 800 rpm के 5 मिनट के लिए फसल. धो centrifugation द्वारा संस्कृति के माध्यम से एक बार और कोशिकाओं और 'कोशिकाओं को बीएसएस समाधान में गोली (2 मिमी CaCl 2 के अलावा बिना, माइक्रोन रेंज युक्त 2 Ca +) फिर से निरस्त करने और कोशिकाओं को एक hematometer का उपयोग कर संख्या गिनती. जोड़ें एक क्वार्ट्ज क्युवेट (10 मिमी, Starna कक्ष) में ~ 10 6 कोशिकाओं और बीएसएस के साथ 2 मिलीलीटर मात्रा को भरने के लिए. Spectrofluorometer में क्युवेट एक चुंबकीय पट्टी के साथ सरगर्मी रखें. इसके साथ ही 510 एनएम के तरंग दैर्ध्य उत्सर्जन के साथ प्रतिदीप्ति एफ 380nm 340nm और एफ संकेतों रिकॉर्ड. चल रहा है प्रोटोकॉल है 1 μl thapsigargin की बीएसएस, 0.5 μl EGTA (0.25 एम स्टॉक) के अलावा, इसके अलावा:(टीजी, 10 मिमी स्टॉक), 4 μl 2 (एम 1 शेयर) सीए के अलावा. 2. सभ्य कोशिकाओं में mn शमन परख 0 से 39.8 माइक्रोन के लिए लेकर सीए isosbestic बिंदु के रूप में एकाग्रता स्वतंत्र तरंगदैर्ध्य निर्धारित एकाग्रता उत्तेजना तरंगदैर्ध्य प्रदर्शन करना विभिन्न 2 Ca युक्त समाधान में Fura-2 स्कैनिंग. आमतौर पर, isosbestic बिंदु पर या 360 एनएम के आसपास है. KYSE 150 कोशिकाओं गिलास नीचे व्यंजन में संवर्धित कर रहे हैं और Fura – 2 के साथ भरा हुआ है. 5 अलग बीएसएस समाधान के साथ छिड़काव प्रणाली सेट करें: सीए 2 + (2 मिमी), / EGTA के टीजी (0.5 मिमी और 5 माइक्रोन, क्रमशः), 2 (0.5 मिमी, EGTA या + सीए 2 के अलावा बिना, करोड़ मुक्त युक्त 2 + माइक्रोन रेंज में) ca, 2 करोड़ + / (75 माइक्रोन) 2 – APB, / EGTA Triton एक्स 100 (0.1%). खुर्दबीन के मंच पर पकवान माउंट और 510 में उत्तेजना तरंगदैर्य 360 एनएम और 390 एनएम और उत्सर्जन के साथ "उत्तेजना अनुपात" मोड का चयन करेंएनएम. इसके साथ ही प्रतिदीप्ति संकेत F अनुपात के साथ 390nm 360nm और एफ एफ (390nm 360nm / एफ) तीसरे विंडो में प्रदर्शित रिकॉर्ड. चल रहा है प्रोटोकॉल है: सीए 2 + 1 मिनट के लिए प्रतिदीप्ति स्थिर करने के लिए 2 करोड़ + 30 सेकंड, 10 मिनट के लिए / EGTA टीजी 2 करोड़ + 2 मिनट के लिए, EGTA Triton एक्स 100 (0.1%) 1 मिनट के लिए पृष्ठभूमि पढ़ने प्राप्त करने के लिए. Mn 2 समाधान + / 2 – APB 2 करोड़ की बजाय से प्रतिदीप्ति शमन समाप्त कर दिया है, जो इंगित करता है कि दो करोड़ + प्रविष्टि SOCE मार्ग के माध्यम से होता है की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. 3. मांसपेशियों की कोशिकाओं में mn शमन परख C2C12, एक माउस myogenic सेल लाइन, गिलास नीचे व्यंजन पर 5% सीओ 2 के वातावरण में सुसंस्कृत है DMEM मध्यम युक्त 10% भ्रूण गोजातीय सीरम, 10% के घोड़े सीरम में 37 ° C. के बाद कोशिकाओं संगम तक पहुँचने, संस्कृति के माध्यम भेदभाव माध्यम से बदल जाता है (हटायें भ्रूण गोजातीय सीरम और reducई घोड़ा 2.5% करने के लिए सीरम). C2C12 myoblasts myotubes में 4 दिनों के बाद अलग होगा. 5 माइक्रोन की अंतिम एकाग्रता Fura-2 के रूप में 1.4-1.6 में वर्णित हूँ साथ लोड C2C12 myotubes के. 20 माइक्रोन एन – लोबान पी टोल्यूनि sulphonamide (टी एस) के अंतिम एकाग्रता जोड़ें मांसपेशी संकुचन और गति की वजह से कलाकृतियों को बाधित करने के लिए और प्रयोग शुरू करने से पहले 15 मिनट की अनुमति. ने युक्ति से जुड़े खुर्दबीन के मंच पर पकवान माउंट और छिड़काव प्रणाली में निम्नलिखित बीएसएस समाधान लोड: 2 Ca 2 (2 मिमी), 0 2 Ca + करोड़ + 2 (0.5 मिमी); करोड़ 2 + टीजी / (0.5 मिमी, 20 माइक्रोन, क्रमशः). छिड़काव प्रणाली के रूप में ऊपर वर्णित सेट. इसके साथ ही अनुपात (एफ 390nm 360nm / एफ) तीसरे विंडो में प्रदर्शित के साथ प्रतिदीप्ति एफ 390nm 360nm और एफ संकेतों रिकॉर्ड. चल रहा है प्रोटोकॉल है: 2 + 1 मिनट के लिए, 0 सीए 2 + 1 मिनट के लिए fl Ca 2दूर ush 2 Ca, MN 2 + .5 मिनट के लिए, 2 करोड़ + / 10 मिनट, और 2 करोड़ के लिए टीजी / एक्स-100 EGTA ट्राइटन (0.1%). 4. चमड़ी मांसपेशी फाइबर में spatially और अस्थायी हल SOCE निम्नलिखित समाधान तैयार. Isotonic Tyrode बफर: 140 मिमी NaCl, 5 मिमी KCl, 10 मिमी HEPES, 2 मिमी 2 MgCl, 2.5 मिमी 2 CaCl, 7.2 पीएच, 290 mosm संस्कृति के माध्यम: साथ DMEM 2% घोड़े सीरम और 1% पेनिसिलिन और स्ट्रेप्टोमाइसिन # 1 समाधान धो: 109.6 मिमी कश्मीर ग्लूटामेट, 2 EGTA KOH मिमी, 6.7 मिमी 2 MgCl, 2 मिमी एटीपी, 6 मिमी (सीपी) creatine फॉस्फेट, 20 मिमी एन, एन बीआईएस (2 hydroxyethyl) 2 – aminoethanesulfonic एसिड (BES) KOH, पीएच 7.0 140 मिमी कश्मीर ग्लूटामेट, 5 – EGTA KOH मिमी, 6.5 मिमी 2 MgCl, 2 मिमी एटीपी, 6 मिमी सी.पी., 20 मिमी BES KOH, पीएच 7.0: # 2 समाधान धो 140 मिमी कश्मीर ग्लूटामेट, 6.5 मिमी 2 MgCl, 2 मिमी एटीपी, 6 मिमी सी.पी., 20 BES – KOH मिमी, पीएच 7.0: समाधान skinning टीटी लोडिंगसमाधान: 90.6 मिमी कश्मीर ग्लूटामेट, 18 ना – ग्लूटामेट मिमी, .55 मिमी 2 CaCl, 2 EGTA KOH मिमी, 6.7 मिमी 2 MgCl, 5.4 एटीपी मिमी, 15 मिमी सी.पी., 0.0025 मिलीग्राम / एमएल creatine kinase (सी), 20 मिमी BES KOH, 5 माइक्रोन कार्बोनिल साइनाइड (FCCP) पी trifluoromethoxyphenylhydrazone, पीएच 7.0, पीसीए 7.0 एसआर लोड हो रहा है समाधान: 107.8 मिमी कश्मीर ग्लूटामेट, 0.98 मिमी 2 CaCl, 2 मिमी EGTA है – KOH, 6.6 मिमी 2 MgCl, 5.4 मिमी एटीपी, 15 मिमी सी.पी., .0025 मिलीग्राम / एमएल सी.के., 20 मिमी BES KOH, 5 माइक्रोन FCCP, पीएच 7.0, 6.6 पीसीए एसआर घट समाधान: 100 मिमी कश्मीर ग्लूटामेट, 40 ना-ग्लूटामेट मिमी, 10 EGTA KOH मिमी, 10 मिमी (ओ – aminophenoxy) 1,2 – बीआईएस एटैन एन, एन, एन ', एसिड N'tetraacetic (BAPTA ), 0.35 मिमी 2 MgCl, 0.5 मिमी एटीपी, 1 मिमी सी.पी., 20 मिमी BES KOH, 5 माइक्रोन FCCP, 7.0 पीएच. 25 मिमी caffeine/20 माइक्रोन thapsigargin (टीजी) प्रयोगों से पहले जोड़ रहे हैं. Extensor digitorum longus मांसपेशी (EDL) काटना, पहले नीचे रखना चूहों और पार्श्व स्थिति में पैर की व्यवस्था तो घुटने से टखने क्षेत्र से त्वचा हटायें कटौतीसतही ऊतक की मांसपेशी परतों edl का पर्दाफाश करने के लिए, और दोनों ऊपरी और निचले, tendons तोड़ बरकरार edl का मांसपेशी मुक्त है, यह महत्वपूर्ण है, tendons रखना संभव के रूप में लंबे समय के रूप में. Edl का 0 2 सीए और 0.1 मिमी EGTA Tyrode युक्त किसी भी संकुचन को रोकने के समाधान के लिए स्थानांतरित कर रहा है. Stereomicroscope के तहत, दो चिमटी का उपयोग करने के लिए कम प्रविष्टि, tendons पकड़ और दो बंडलों में edl का मांसपेशी विभाजित. प्रक्रिया को दोहराएं 4 और फिर 8 बंडलों प्राप्त करने के लिए. यह महत्वपूर्ण है कि tendons प्रत्येक प्रक्रिया के अंत में 8 बंडलों के लिए रहना है. अगर वे कुछ बंडलों से खो रहे हैं, उन्हें त्यागने. Stereomicroscope के तहत, प्रत्येक edl का बंडल पट्टी दोनों, tendons पर griped है और ध्यान से बढ़ाकर 3 तक ~ 4 अलग एक मांसपेशी फाइबर दोनों पक्षों पर पट्टा के साथ बरकरार रह गए हैं. 1 2 सीए के बूंद रखो गिलास नीचे पकवान की बीच में मुफ्त tyrode के बफर, नीचे पकवान पर सीधे edl का स्ट्रिप्स करना, जल्दी के रूप में संभव के रूप में ज्यादा दूरसमाधान है, तो दोनों पानी प्रतिरोधी स्कॉच टेप, और यकीन है कि टेप का उपयोग कर, tendons के नीचे टेप तंग है. फाइबर 0 Ca 2 समाधान के साथ और फिर एक 2.5 मिमी सीए 2 + समाधान 2 बार के साथ पहले धो. यदि फाइबर अति अनुबंध और नुकसान देखा है, फाइबर त्यागें. यदि आवश्यक हो, फाइबर के लिए संवर्धित किया जा सकता है 96 घंटे के लिए, आनुवंशिक जोड़तोड़ के लिए अनुमति देता है. पूरी संस्कृति के माध्यम से फाइबर 3 बार धोयें और जोड़ने के पकवान में 2 मिलीलीटर मध्यम, 5% सीओ 2 और 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में जगह. प्रत्येक प्रयोग से पहले, मांसपेशी फाइबर की जांच करने और स्पष्ट striation बिना उन या प्रदूषण के संकेत के साथ, या sarcolemmal झिल्ली की contracture के रूप में क्षति के लक्षण के साथ त्यागें. अच्छा फाइबर, KCl, बिजली, उत्तेजना, और कैफीन उत्तेजना का जवाब. एक मांसपेशी फाइबर धोने समाधान # 1 के साथ 3 बार धोया जाता है और 500 Rhod-5N माइक्रोन और 0.5 मिमी 2 Ca के साथ intracellular तरह skinning समाधान में स्नान 5 मिनट के लिए. <ली> टंगस्टन एक पिन धारक से जुड़ी, यंत्रवत् त्वचा stereomicroscope के तहत फाइबर सुई का प्रयोग, स्वतः reseal करने के लिए और Rhod-5N 2 Ca साथ संयुग्मित जाल अनुप्रस्थ tubules (टीटी) की अनुमति + टीटी में, चमड़ी फाइबर दो बार धोना # 2 समाधान धोने के साथ. यांत्रिक skinning प्रक्रिया इष्टतम है जब सेल चौड़ाई का 25% से कम skinning प्रक्रिया के दौरान हटा दिया है. एसआर लोड, चमड़ी फाइबर skinning 20 माइक्रोन Fluo-5N कमरे के तापमान 1 घंटे के लिए धन्यवाद, एक अतिरिक्त 30 मिनट के लिए व्यापक धोने # 2, और समाधान सेते हैं का उपयोग कर washes के द्वारा पीछा करने की अनुमति देते युक्त समाधान के साथ incubated हैं डे esterification पूर्ण डाई की. 30 मिनट के बाद, चमड़ी फाइबर confocal सूक्ष्मदर्शी की 60x उद्देश्य के तहत कल्पना की जाती है. प्रतिदीप्ति छवियों इसी रंजक (Fluo-5N के लिए 530-560 एनएम पर 488 एनएम और उत्सर्जन में उत्तेजना 543 एनएम और Rhod-5N के लिए 570 एनएम से लंबे समय तक उत्सर्जन में उत्तेजना) की तरंग दैर्ध्य को हासिल कर रहे हैं. Regiब्याज की ऑन (ROIs) प्रत्येक डाई लोड क्षेत्रों के लिए चयन कर रहे हैं. प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल के रूप में निम्नलिखित है: 120, 120, 400-750 एसआर Ca 2 दुकान व्यय के लिए एसआर – कमी समाधान के लिए एसआर लोडिंग समाधान के लिए समाधान टीटी लोड हो रहा है. इस प्रक्रिया के दौरान, Rhod-5N तीव्रता में परिवर्तन (टीटी Ca + 2) और Fluo के 5N तीव्रता (आर Ca + 2) दर्ज की गई, टीटी और एसआर में रिश्तेदार प्रतिदीप्ति परिवर्तन का एक समय बेशक दृढ़ संकल्प का निर्माण कर रहे हैं. प्रतिदीप्ति तीव्रता से एकाधिक फाइबर के मूल्यों मीन आगे विश्लेषण कर रहे हैं. TT / SR लोडिंग के अंत में अधिक से अधिक लोड हो रहा है तीव्रता 100% करने के लिए सामान्य है. 5. प्रतिनिधि परिणाम हम KYSE 150 कोशिकाओं में SOCE गतिविधि की जांच intracellular 2 सीए का उपयोग + माप (चित्र 2.). पत्रकार के रूप में आरएफपी का उपयोग करना, हम व्यक्तिगत orai1 के खिलाफ प्लाज्मिड युक्त विशिष्ट shRNA साथ ट्रांसफ़ेक्ट कक्षों का चयन कर सकता है, एक जीन SOCE ग एन्कोडिंगhannel. हाथापाई (काला ट्रेस) shRNA Orai1 कम SOCE गतिविधि (लाल ट्रेस) में प्रोटीन परिणाम के नीचे दस्तक. युक्त plasmids के साथ ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं के साथ तुलना में SOCE KYSE 150 कोशिकाओं में भी 2 + शमन परख (चित्र 3.) करोड़ के साथ पुष्टि की गई. 360 एनएम के तरंग दैर्ध्य उत्तेजना Fura-2 isosbestic बिंदु, जहां प्रतिदीप्ति सीए 2 + एकाग्रता के स्वतंत्र है रिपोर्ट. बाद टीजी पूरी तरह से ईआर 2 Ca समाप्त + भंडार, 2 करोड़ का छिड़काव एक महत्वपूर्ण प्रतिदीप्ति कमी के परिणामस्वरूप. समग्र SOCE गतिविधि में Fura-2 एक steeper ढाल के साथ एक और अधिक सक्रिय SOCE का संकेत प्रतिदीप्ति तीव्रता की कमी दर से मापा जा सकता है, जबकि एक shallower ढलान अर्थ एक कम सक्रिय SOCE. 2 – APB इलाज किया कोशिकाओं में प्रतिदीप्ति कमी की ढलान बहुत shallower है, जो संकेत कि SOCE गतिविधि इस परिसर के द्वारा अवरोधित की गई है होना को दिखाई दिया. करोड़+ 2 शमन दर प्रारंभिक 10 सेकंड, जहां शमन रेखीय श्रृंखला में अभी भी संतृप्ति के बिना था के रिकॉर्ड से निर्धारित किया गया है. एक समान करोड़ 2 + शमन परख मांसपेशी (चित्र 4.) में किया गया था. इस मामले में 2 करोड़ साथ टीजी के साथ लागू किया गया था. जबकि टीजी एसआर Ca 2 भंडार घट गया था, प्रतिदीप्ति शमन ढलान धीरे – धीरे बदल जब तक यह अपनी अधिक से अधिक दर पर पहुंच गया. sigmoidal वक्र SOCE के इन प्रयोगात्मक शर्तों के तहत वर्गीकृत सक्रियण इंगित करता है. स्वस्थ बरकरार संस्कृति में एक मांसपेशी फाइबर में स्पष्ट और वर्दी striation, contaminations का कोई संकेत नहीं है, और संकुचन प्रेरित नुकसान का कोई संकेत नहीं दिखाया. इन तंतुओं के लिए बिजली की उत्तेजना या depolarizing समाधान के लिए प्रतिक्रिया में अनुबंध करने में सक्षम थे. Confocal इमेजिंग के तहत, चमड़ी Rhod-5N डाई टीटी डिब्बे में फाइबर फँसाने विशेषता स्तनधारी नक़ल पैटर्न से पता चला है (विसूलाल चैनल में alized). Fluo-5N AM साथ एसआर लोड करने के बाद, ठेठ punctuated है एसआर पैटर्न दिखाई दे रहा था (ग्रीन चैनल में). TT / एसआर लोड हो रहा है समाधान के साथ चमड़ी फाइबर के छिड़काव पर, दोनों Rhod 5N और Fluo-5N प्रतिदीप्ति तीव्रता में वृद्धि, एसआर कमी समाधान के साथ छिड़काव पर, एसआर डिब्बे और टीटी डिब्बे में प्रतिदीप्ति स्तर को कम करने के लिए शुरू, तंग युग्मन का संकेत है एसआर Ca 2 के बीच + दुकान कमी और SOCE सक्रियण, क्रमशः (चित्र 5.). आकृति 1. के सक्रियकरण की दुकान संचालित 2 Ca + (SOCE) प्रविष्टि Orai1., एक चैनल इकाई बनाने ताकना, प्लाज्मा (प्रधानमंत्री) झिल्ली और STIM1 के एक CA 2 सेंसर + पर स्थित है, है endoplasmic या sarcoplasmic जालिका (ईआर / पर स्थित है एसआर झिल्ली). जब ईआर / एसआर सीए 2 + भंडार या तो ईआर एसआर / 2 + पंप (एसईआरसी Ca अवरुद्ध की वजह से कम कर रहे हैं) एक या 2 Ca आईपी -3 रिसेप्टर या ryanodine रिसेप्टर के माध्यम से जारी +, STIM1 सक्रिय है. सक्रिय STIM1 अणुओं पैच फार्म और Orai1 का एकत्रीकरण है, जो आगे SOCE के सक्रियण जाता है प्रेरित. चित्रा 2. Intracellular क्षमताओं के 2 + KYSE 150 कोशिकाओं में माप बाह्य समाधान के intracellular + 2 Ca में किसी भी परिवर्तन + 0 + 2 (0.5 मिमी EGTA) Ca 2 मिमी Ca 2 से विनिमय के लिए प्रेरित नहीं किया. 5 0 2 सीए + स्नान समाधान प्रेरित निष्क्रिय ईआर Ca 2 रिलीज में टीजी माइक्रोन. बाद ईआर सीए 2 + भंडार समाप्त हो गया है (10 मिनट), कोशिकी Ca 2 (2 मिमी) के अलावा SOCE, जो SOCE inhibitors के द्वारा अवरुद्ध किया जा सकता है के माध्यम से एक निरंतर intracellular Ca 2 ऊंचाई + सक्रिय, जैसे SKF 96,365 और 2 – APB (दिखाने के लिए नहीं डेटा). ShRNA के खिलाफ विशेष रूप से युक्त plasmids के साथ ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओंorai1 (लाल) काफी हाथापाई अनुक्रम (काला) के साथ ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं की तुलना में कम SOCE प्रदर्शन किया. चित्रा 3. 2 करोड़ + SOCE की KYSE 150 कोशिकाओं में शमन परख + 2 (0.5 मिमी) करोड़ में Fura 2 प्रतिदीप्ति शमन 2 + स्वतंत्र Fura 2 – (360 एनएम) के तरंगदैर्ध्य उत्तेजना Ca में मापा गया था. कोशिकाओं के साथ इलाज किया गया 10 मिनट के लिए 5 टीजी माइक्रोन के लिए पूरी तरह से ईआर Ca 2 भंडार खलाना. क्षय ढलान Fura प्रतिदीप्ति-2 का 2 करोड़ पर अतिरिक्त (डेश लाइनों, पहले 10 सेकंड के भीतर) SOCE के सक्रियण, जो प्रतिदीप्ति प्रतिशत की कमी में प्रति इकाई समय (100% के रूप में प्रारंभिक मूल्य) के रूप में व्यक्त किया गया था का प्रतिनिधित्व किया. ज़्यादा से ज़्यादा बुझती प्रतिदीप्ति संकेत के साथ lysing कोशिकाओं द्वारा प्रयोग के अंत में स्थापित किया गया था 0.1% Triton एक्स 100 (0% के रूप में). APB-2 (75 माइक्रोन) के साथ इलाज किया कोशिकाओं का प्रदर्शन एक बहुत shallowerढलान, सुझाव SOCE KYSE 150 कोशिकाओं में इस परिसर के द्वारा अवरुद्ध है. चित्रा 4. SOCE की 2 करोड़ से पता चला मांसपेशी कोशिकाओं में वर्गीकृत सक्रियकरण + शमन परख SOCE के सक्रियकरण जबकि टीजी एसआर 2 Ca भंडार + घट गया था पंजीकृत किया जा सकता है. करोड़ + 2 (0.5mm) और टीजी (20 माइक्रोन) के साथ – साथ आवेदन intracellular Fura 2 (सियान पानी का छींटा लाइन के लिए तेजी से शमन बिंदु दिखाने) प्रतिदीप्ति, जो प्रारंभिक 2 करोड़ से अलग था + शमन वर्गीकृत और sigmoidal कमी के प्रेरित किया. दर (नीले पानी का छींटा लाइन). दो करोड़ + शमन ढाल बने रहे लगभग इलाज APB-2 (75 माइक्रोन) कोशिकाओं में बेसल स्तर के रूप में एक ही है, कि SOCE हिचकते किया गया था सुझाव दे. चित्रा 5. Spatially और अस्थायी चमड़ी मांसपेशी फाइबर में SOCE हल. (ए) आरएचआयुध डिपो-5N नमक टीटी और Fluo-5N AM में लोड किया गया था एसआर में लोड किया गया था. (बी) 2 सीए + कमी समाधान लागू करने के बाद, दोनों टीटी और एसआर डिब्बों में प्रतिदीप्ति कमी हुई. Fluo-5N प्रतिदीप्ति के नुकसान का संकेत तेजी एसआर Ca जारी 2 + सामग्री और Rhod-5N प्रतिदीप्ति का नुकसान SOCE की सक्रियता का सुझाव दिया.

Discussion

हालांकि ² Ca ⁺ बंधन और ² Ca ⁺ मुक्त Fura-2 के लिए उत्तेजना तरंगदैर्य 340 एनएम और 380 एनएम हैं, क्रमशः, ² कैरियर के लिए सबसे अच्छा अनुपात Fura-2 की गतिशील रेंज ⁺ एकाग्रता माप अन्य तरंगदैर्य पर एक विशेष रूप से हो सकता है खुर्दबीन प्रणाली. तरंग दैर्ध्य में इस तरह के बदलाव के विभिन्न ऑप्टिकल घटकों के अलावा के साथ ऑप्टिकल पथ में परिवर्तन के कारण आम तौर पर कर रहे हैं. इस अध्ययन में, Fura-2 के लिए उत्तेजना तरंगदैर्य 350 एनएम और 390 एनएम के रूप में Fura-2 प्रतिदीप्ति की वर्णक्रमीय विश्लेषण प्रदर्शन द्वारा निर्धारित किया गया है.

intracellular सीए ^{2 +} सहित कई स्रोतों में से एक संतुलन से cytosol परिणामों में स्तर intracellular ² Ca ⁺ रिलीज, कोशिकी Ca ² प्रवेश ⁺ के रूप में के रूप में अच्छी तरह से सीए ईआर और प्लाज्मा झिल्ली में ^{2 +} बहिष्कार तंत्र. के intracellular सीए ^{2 +} रिहाई और ^{2 +} Ca extr से यूनिडायरेक्शनल समाज की मध्यस्थता ² Ca ⁺ बाढ़ अलगusion, MN ² शमन परख इस्तेमाल किया जा सकता है. ⁺ करोड़ ² SOCE के माध्यम से कोशिकाओं में तर करने के लिए सक्षम होने के लिए जाना जाता है, लेकिन सतह झिल्ली बाहर निकालना या ² सीए द्वारा ईआर तेज पंप ⁺ करने के लिए अभेद्य है. इसलिए, प्रतिदीप्ति शमन के यूनिडायरेक्शनल करोड़ ² प्रवाह ⁺ कोशिकाओं में एक माप है कि SOCE के सक्रियण की डिग्री का अनुमान का प्रतिनिधित्व करता है. ^दो करोड़ ⁺ शमन परख isosbestic बिंदु पर किया जाता है, जैसे तरंगदैर्ध्य में Fura 2 प्रतिदीप्ति तीव्रता ² एकाग्रता ⁺ Ca स्वतंत्र है. हर सिस्टम के लिये isosbestic बिन्दु स्पेक्ट्रम स्कैनिंग द्वारा निर्धारित किया जाना चाहिए. वैकल्पिक रूप से, इस तरह से है कि अंतिम मूल्य ^{2 + 13} एकाग्रता Ca स्वतंत्र है में कोई दो तरंगदैर्य पर करोड़ ^{2 +} शमन समायोजित प्रतिदीप्ति द्वारा दर्ज किया जा सकता है.

कंकाल की मांसपेशियों में SOCE की गतिविधि के स्थानिक और लौकिक जानकारी हासिल करने के लिए, हम दोहरे डाई की एक विधि है, जो की अनुमति देता है एक साथ measureme कार्यरत हैंSOCE गतिविधि और एसआर सीए ^{2 +} सामग्री चमड़ी वयस्क स्तनधारी edl का मांसपेशी फाइबर में NT के. एसआर CA में ² परिवर्तन के बीच संबंध ⁺ सामग्री और SOCE गतिविधि सीमा और एसआर Ca ² की कमी ⁺ भंडारण के लिए SOCE सक्रियण की संवेदनशीलता का संकेत करने के लिए साजिश रची जा सकता है. टीटी लोडिंग समाधान के लिए अतिरिक्त सीए के साथ ² टी tubules लोड करने के लिए अनुकूलित है ⁺ और ​​टी tubules और समाधान एसआर लोडिंग की भड़काना के लिए अधिक से अधिक एसआर सीए ^{2 +} लोड हो रहा है को बढ़ावा देने और अतिरिक्त टी tubules लोड करने के लिए डिज़ाइन किया गया है ~~ 500 माइक्रोन Ca ^{2 के साथ.} FCCP समाधान / टीटी एसआर लोड हो रहा है और SR से घट समाधान के mitochondria से प्रभाव को खत्म करने में शामिल है.

Materials

Table of specific reagents and equipment:

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments
RPMI 1640	Mediatech	10-040-CV
Ham’s F-12	Mediatech	10-080-CV
DMEM	Mediatech	10-013-CV
Glass Bottom Dish	MatTek	P35G-1.5-14-C
Fura-2 AM	Invitrogen (Molecular Probes)	F1221	-20°C, seal tight, protected from light, dissolved into DMSO
Fluo-5N AM	Invitrogen (Molecular Probes)	F14204	-20°C, seal tight, protected from light
Rhod-5N	Invitrogen (Molecular Probes)	R14207	-20°C, seal tight, protected from light
Quartz Cuvette	Starna Cells	3-Q-10
thapsigargin	Tocris	1138
2-Aminoethoxydiphenylborane (2-APB)	Tocris	1224
N-benzyl-p-toluene sulphonamide (BTS)	Sigma-Aldrich	435600
Collagenase Type I	Sigma	C0130

Equipment:

1. A spectrofluorometer (Photon Technology International, NJ): xenon arc lamp, computer-controlled high-speed random access monochromator, cuvette-based emission monochromator, Nikon TE-200 inverted fluorescence microscope, S Fluor 40x/1.30 oil objective, PMT detectors.
2. Laser Scanning Confocal Microscope (BioRad Radiance2100): argon laser 453/477/488/514, HeNe laser 543nm, Nikon TE2000 inverted microscope, 60X objective (N.A. 1.4, oil).
3. A stereomicroscope with a magnification power > 100 (Zeiss Stemi SV11 Apo).