Måling af cytosole Ca 2 + I isolerede kontraktile lymfekar

Summary

Vi introducerer en tilgang til at evaluere cytosol Ca^{2 +} Koncentration i isolerede lymfevejene at studere Ca^{2 +}-Afhængige og Ca^{2 +}-Sensibiliserende mekanismer af lymfatisk glatte muskelsammentrækning.

Abstract

Lymfekar omfatter et multifunktionelt transport-system, der sikrer flydende homeostase, leverer lipider til den centrale cirkulation, og fungerer som et overvågningssystem for potentielt skadelige antigener, optimering slimhinde immunitet og adaptive immunrespons ^1. Lymfeknuder er dannet af interstitiel væske, der kommer ind blind-ended indledende lymfevejene, og derefter transporteres mod et tryk gradient i større indsamling lymfevejene. Hver indsamle lymfe består af en række segmenter kaldet lymphangions, adskilt af bicuspid ventiler, der forhindrer tilbageløb. Hver lymphangion besidder en kontraktile cyklus, der driver lymfeknuder mod et tryk gradient mod det centrale cirkulation ^2. Denne phasic kontraktile mønster svarer til hjertets cyklus, med et systolisk og diastolisk faser, og med en lavere sammentrækning frekvens ^4. Desuden genererer lymfe glat muskeltonus og viser myogenic konstriktion og dilatation jegn reaktion på stigninger og fald i luminale pres, henholdsvis ^5. En hybrid af molekylære mekanismer, der understøtter både phasic og tonic kontraktilitet af lymfevejene er således foreslået.

Sammentrækning af glat muskulatur er generelt reguleret af cytosole Ca ^{2 +} koncentration ([Ca ^{2 +]} _i) plus følsomhed for Ca ^{2 +,} af de kontraktile elementer i reaktion på ændringer i miljøet omkring cellen ^6. [Ca ^{2 +]} _Jeg er bestemmes af kombinationen af den frie bevægelighed for Ca ^{2 +} gennem plasmamembranen ligand eller spændingsfølsomme Ca ^{2 +} kanaler og frigivelse og optagelse af Ca ^{2 +} fra interne butikker. Cytosole Ca ^{2 +} binder sig til calmodulin og aktiverer enzymer såsom myosin lyskæde (MLC) kinase (MLCK), som igen phosphorylates MLC fører til actin-myosin-medieret kontraktion ^8. Men følsomheden af ​​denne vej til Ca <sup> 2 + kan reguleres af MLC fosfatase (MLCP) ^9. MLCP virksomhed er omfattet af Rho-kinase (ROCK) og myosin fosfatase-hæmmer protein CPI-17.

Her præsenterer vi en metode til at vurdere ændringer i [Ca ^{2 +]} _i over tid i isolerede, perfunderet lymfevejene for at studere Ca ^{2 +-afhængige} og Ca ^{2 +-sensibiliserende} mekanismer af lymfatisk glatte muskelsammentrækning. Brug af isolerede rotte mesenteriallymfeknuderne indsamle lymfevejene vi studerede stretch-inducerede ændringer i [Ca ^{2 +]} _i og kontraktile aktivitet. Den isolerede lymfe-modellen har den fordel, tryk, flow, og den kemiske sammensætning af badet løsningen kan blive nøje kontrolleret. [Ca ^{2 +]} _Jeg blev bestemt ved at indlæse lymfevejene med ratiometrisk, Ca ^{2 +-bindende} dye Fura-2. Disse undersøgelser vil give en ny tilgang til det bredere problem med at studere de forskellige molekylære mekanismer, der regulerer phasicsammentrækninger versus tonic konstriktion i lymfe glatte muskulatur.

Protocol

1. Dyr Alle procedurer blev godkendt af Institutional Animal Care og bruge udvalget ved Louisiana State University Health Sciences Center, og blev udført i overensstemmelse med retningslinjerne fra National Institute of Health (NIH publikation nr. 85-12, revideret 1996). Mand Sprague-Dawley rotter (Charles River Laboratories, 270-350 g krop wt) blev anbragt i en kontrolleret temperatur (22 ° C) og kontrolleret belysning (00:12 H lys mørke cyklus) miljø. Efter ankomsten blev rotterne indgivet til en uges a…

Discussion

En ny kombination af metoder, der var ansat til at studere iboende pumpning af lymfekar. Evnen til samtidigt at måle ændringer i [Ca ^{2 +]} _i og diameter i pumpe lymfevejene vil give mulighed for studier af de relative bidrag af Ca ^{2 +-afhængige} og Ca ^{2 +-sensibiliserende} signalveje i den samlede ordning, der gælder for lymfe kontraktile cyklus.

Det lymfe kontraktile cyklus består af phasic sammentrækninger ovenpå tone. Dataene viser, at hver …

Materials

<tdChemical

1. Ringer 5x Stock
Company	Catalog Number	Amount
Sodium Chloride	EMD	SX0420-3	35 g
Potassium Chloride	J.T. Baker	3040	1.75 g
Calcium Chloride	Sigma	C-3881	1.47 g
Magnesium Sulfate	Sigma	M-9397	1.44 g
Sterile Filtered Water	N/A	N/A	Bring to 1 L
Sterile filter into autoclaved bottles and stores at 4 °C
2. MOPS buffer
Chemical	Company	Catalog Number	Amount
MOPS	Sigma	M3183	125.6 g
Sterile Filtered Water	N/A	N/A	Bring to 1 L
Sterile filter into autoclaved bottles and stores at 4 °C
3. Albumin Physiological Salt Solution (APSS)
Chemical	Company	Catalog Number	Amount
Ringer stock (5x)	N/A	N/A	200 mL
Mops Buffer	N/A	N/A	5 mL
Sodium Phosphate	Sigma	S-9638	0.168 g
Sodium Pyruvate	Sigma	P5280	0.22 g
EDTA sodium salt	Sigma	ED2SS	0.0074 g
Glucose	Sigma	G7528	0.901 g
Albumin, Bovine	USB	10856	10 g
Sterile Filtered Water	N/A	N/A	Bring to 1 L
Adjust pH to 7.4 at 37° C, then sterile filter into autoclaved bottles and store at 4 °C.

Table 1. Specific Reagents Used. Store all at 4 °C.