الكمية والآلي عالية الإنتاجية الجينوم على نطاق شاشات رني في C. ايليجانس</em

Summary

وصفنا باستخدام بروتوكول<em> C. ايليجانس</em> والمكتبات التغذية رني أن يسمح قياس الآلي للمعلمات متعددة مثل الحجم، ومضان والتعتيم من الديدان الفردية في عدد السكان. نعطي مثالا واحدا على الشاشة لتحديد الجينات المسؤولة عن مضاد للفطريات في المناعة الفطرية<em> C. ايليجانس</em>.

Abstract

تدخل الجيش الملكي النيبالي هو وسيلة قوية لفهم وظيفة الجينات، وخصوصا عندما تجرى على نطاق كامل الجينوم وكذلك في سياق كمي. في C. ايليجانس، يمكن طرقت وظيفة الجين أسفل ببساطة وكفاءة عن طريق تغذية الديدان مع بكتيريا تعبر عن الرنا المزدوج الجديلة المقابلة لجين معين ^1. في حين أن إنشاء مكتبات من الحيوانات المستنسخة رني تغطي معظم C. ايليجانس جينوم ^2،3 فتح الطريق لدراسات الجينوم صحيح وظيفية (انظر على سبيل المثال ^4-7)، ومعظم الطرق المنشأة هي شاقة. وقد وضعت موي وزملاؤه شبه الآلي البروتوكولات التي تسهل الجينوم على نطاق شاشات ^8. نهج يعتمد على التصوير المجهري وتحليل الصور.

نحن هنا وصف بروتوكول بديل عن شاشة الجينوم على نطاق عالية الإنتاجية، على أساس التعامل مع الروبوت من الحيوانات المستنسخة رني البكتيرية، والتحليل الكمي باستخدام Biosort COPAS (الاتحاد Biometrica (يو بي آي))، وبرامج متكاملة: MBioLIMS (مختبر نظام المعلومات الإدارية من MODUL-BIO) التكنولوجيا التي توفر المزيد من المخرجات لإدارة البيانات وتتبع عينة. أسلوب يسمح أجريت على لوحات شاشات المتوسطة الصلبة. هذا مهم بشكل خاص لبعض الدراسات، ومثل هذه التفاعلات المضيف الممرض في معالجة C. ايليجانس، منذ بعض الميكروبات لا تصيب الديدان بكفاءة في ثقافة السائل.

نظهر كيف يمكن استخدام طريقة لقياس أهمية الجينات المضادة للفطريات في المناعة الفطرية في C. ايليجانس. في هذه الحالة، نهج يعتمد على استخدام سلالة معدلة وراثيا يحمل البشرة العدوى محرض الجينات مراسل فلوري، مع GFP تحت سيطرة المروج في البرمجة اللغوية العصبية المضادة للجراثيم الببتيد الجين 29 و مراسل أحمر فلوري أن يتم التعبير عن constitutively في البشرة. هذا الأخير يوفر الرقابة الداخلية للوحدة الفنية للبشرةوالتحوير غير محدد إسكات ^9. عندما يصاب الديدان مراقبة من قبل الفطريات التي يتألق الخضراء. هدمت من قبل رني الجين المطلوب من أجل تحقيق النتائج التعبير البرمجة اللغوية العصبية في 29 مضان تقلص بعد الإصابة. حاليا، هذا البروتوكول يتيح لأكثر من 3000 استنساخ رني لفحصها وتحليلها في الأسبوع، وفتح إمكانية فحص الجينوم بأكمله في أقل من 2 أشهر.

Protocol

وينقسم هذا البروتوكول على النحو المبين أدناه في الخطوات التالية على خمسة أيام على التوالي (الشكل 1). كما لوحظ، يمكن القيام ببعض الخطوات في أيام مختلفة. مدة كل خطوة، فضلا عن كمية من المواد المطلوبة وسوف (الديدان على سبيل المثال، البكتيريا، وسائل الاعلام) تعتمد على عدد من 96 لوحات لكل معاملة جيدة تجربة. اليوم 1 1. إعداد لوحات 96-جيدا رني NGM ويتم تكييف البروتوكول التالية من الطريقة القياسية لصنع لوحات ثقافة دودة 10، والذي يتضمن تفاصيل عن تقنيات التعقيم لحلول مختلفة. لوحات لمدة 10-12 96-جيدا، وإعداد 100 مل من وسائط النمو النيماتودا (NGM) في منزوع الأيونات O 2 H: 1.7 غرام BactoAgar، 0،29 غرام كلوريد الصوديوم، 0.25 ز ببتون، 100 الكوليسترول ميكرولتر (5 ملغ / مل في EtOH). الأوتوكلاف NGM (5 دقائق في 121 درجة مئوية لمدة 100 مل و 30 دقيقة في درجة حرارة 121 مئوية لمدة 4 ليتر) وندعه يبرد حتى يصبح في حوالي 50 درجة مئوية (إينو بارد فقطلاف لعقد). من المهم أن يبقى NGM دافئ بما فيه الكفاية بحيث لا يصلب. إضافة ل100 مل: 2.5 مل من الفوسفات عازلة pH6 (1M)، و 100 MgSO ميكرولتر 4 (1M)، و 100 ميكرولتر CaCl 2 (1M)، و 400 IPTG ميكرولتر (1M)، و 100 أمبيسيلين ميكرولتر (100 ملغ / مل)، و 100 التتراسايكلين ميكرولتر (12.5 ملغ / مل في EtOH). توزيع 75 ميكرولتر من NGM إلى كل بئر من لوحة مسطحة القاع 96-جيدا. لتجنب تجمد المتوسط، لا بد من الاستغناء بسرعة، بل هو مناسب لاستخدام موزع المتكررة (على سبيل المثال Repeatman، إيبندورف). مما لا شك فيه أنه لا توجد فقاعات الهواء الموجودة في الآبار. تخزين لوحات فورا في غرفة رطبة (مثل مربع تثبرور مع المناشف الورقية الرطبة في الجزء السفلي) في 4 درجة مئوية. ملاحظة: يمكن أن تكون مستعدة لوحات تصل إلى أسبوع مقدما وتخزينها في 4 درجات مئوية، وهذا يمكن أن تجعل من تنظيم الخطوات اللاحقة أسهل. 2. آلية إعداد لوحات LB 96-DeepWell <lأنا> تحضير وتوزيع 1.5 LB مل تحتوي على أمبيسيلين 100μg/mL والتتراسايكلين 12.5 ميكروغرام / مل إلى كل بئر من لوحة 96-DeepWell التي لديها القدرة القصوى من 2 مل / جيد. تم تحسين توزيع باستخدام نظام الروبوتية التعامل مع السائل (على سبيل المثال TECAN) ولكن يمكن أيضا أن يقوم يدويا إذا لزم الأمر. إضافة إلى تغطية كل لوحة، ومخزن في 4 درجة مئوية. من أجل تتبع كل لوحة 96-جيدا، يجب إضافة تسمية أو الباركود فريدة من نوعها، في هذه المرحلة أو في وقت لاحق. ملاحظة: يمكن أن تكون مستعدة لوحات 2 إلى 3 أيام مقدما وتخزينها في 4 درجات مئوية، وهذا يمكن أن تجعل من تنظيم الخطوات اللاحقة أسهل. 3. نمو الحيوانات المستنسخة رني البكتيريا في لوحات LB 96-DeepWell (الثقافة بين عشية وضحاها) لسهولة التعامل مع اللاحقة، عندما الأصلي رني استنساخ مكتبة في تنسيق 384 جيدا، وإعادة توزيع لأول مرة في استنساخ المسمى أو شريط مشفر معيار تي لوحات تحتوي على LB مع الأمبير ميكروغرام / 100 مل و 12.5 ميكروغرام / مل 96-جيداتستكمل وآخرون مع الجلسرين (تركيز نهائي 10٪). عندما لوحات أصلية 384 جيدا لم يكن لديك الحيوانات المستنسخة في جميع الآبار، كما هو الحال بالنسبة للالأكثر شيوعا مكتبة "Ahringer"، وهناك خيارات عدة لتنظيم لوحات ابنة. ويمكن استنساخ إعادة توزيعها بحيث لا توجد آبار فارغة في لوحات ابنة. هذا يقلل من عدد من لوحات على الشاشة. من الناحية المثالية، ومع ذلك، أثناء النسخ المتماثل، يجب ترك بعض الآبار في كل لوحة ابنة فارغة، بحيث يمكن في وقت لاحق هذه تكون مليئة استنساخ سيطرة القياسية (الإيجابية والسلبية) التي تسهل عبر لوحة المقارنات. ثم يتم استخدام هذه اللوحات ابنة 96-جيدا لبذرة لوحات LB 96-DeepWell للثقافة (ON) بين عشية وضحاها. تتم جميع الخطوات أفضل التعامل مع السائل مع نظام مناولة السائل الروبوتية (على سبيل المثال Tecan)، ولكن يمكن القيام بها يدويا باستخدام، على سبيل المثال، المكرر 96-دبوس. إذا كانت مكتبة استنساخ رني هي بالفعل في شكل 96-جيدا انتقل إلى الخطوة 3.5. <oل بداية = "2"> احتضان ابنة رني 96-جيدا لوحات في 37 درجة مئوية مع الإثارة (200 دورة في الدقيقة) عن 14-15 ساعة. تحقق من أن البكتيريا نما بشكل صحيح والتعرف على الحيوانات المستنسخة التي لا تنمو. وسيتم استبعاد هذه التحليلات من وقت لاحق. من الناحية المثالية، يقاس OD 600 في كل بئر، ولكن يمكن القيام بذلك عن طريق فحص بسيط. تخزين ابنة رني 96-جيدا لوحات في -80 درجة مئوية قبل الاستخدام. ذوبان الجليد لوحات 96-جيد يحتوي على استنساخ رني في درجة حرارة الغرفة. ويمكن بعد ذلك لوحات يتم الاحتفاظ بها في 4 درجات مئوية حتى استخدامها. توزيع 3 ميكرولتر من كل نسخة من بكتيريا لوحة 96-جيدا تكرار للآبار (96) من لوحة في المقابل وصفت / barcoded LB 96-DeepWell تحتوي على 1.5 مل من LB مع الأمبير ميكروغرام / 100 مل و 12.5 ميكروغرام / مل تيت. ويمكن إدراج استنساخ البكتيرية للسيطرة رني كفاءة، مثل استنساخ (رني) GFP في المثال الحالي، والضوابط السلبية، تماما يدويا في أي الفارغة المتاحة. تغطية ص 96-DeepWellالمرحومين مع فيلم لاصق (على سبيل المثال فيلم AeraSeal ثقافة الخلوية من Dutscher). استبدال لوحة تستخدم 96-جيدا في تكرار -80 درجة مئوية. وحضنت ثم لوحات 96-DeepWell المسمى على على 37 درجة مئوية مع الإثارة (200 دورة في الدقيقة ل14-15 ساعة). اليوم 2 4. البذور والحيوانات المستنسخة رني البكتيرية على لوحات 96-جيدا رني NGM وينبغي القيام بهذه الخطوة في صباح اليوم التالي لثقافة ON. أخذ لوحات 96-جيدا NGM من 4 درجات مئوية والسماح لهم الاحماء وتجف لمدة 5-15 دقيقة في إطار مجلس الوزراء رقائقي تدفق العقيمة. لا تترك لوحات وقتا طويلا تحت غطاء محرك السيارة (بحد أقصى 30 دقيقة)، وإلا فإن NGM قد شن في وقت لاحق. إضافة التسمية المناسبة / الباركود على كل لوحة. استرداد 96-DeepWell على لوحات ثقافة من 37 درجة مئوية. تسجيل المواقف من أي آبار فارغة (بئر فارغة شفافة تماما)، وسيتم استبعاد هذه من تحليلات لاحقة. أجهزة الطرد المركزي ال 96-DeepWell لوحات 5 دقائق في 4000 دورة في الدقيقة. بلاغ طاف من خلال تحويل لوحة بحدة رأسا على عقب وتجفيف حواف لوحة بسرعة على منشفة ورقية. كما أن الثقافات من البكتيريا المؤتلف، وطاف يحتاج إلى أن يعامل وفقا للقوانين المحلية (على سبيل المثال مشبع). Resuspend وبيليه البكتيرية في السائل المتبقي (حوالي 50 ميكرولتر) من قبل vortexing، وذلك باستخدام مثالي محرضا مخصصة (على سبيل المثال Tecan) بحيث يتلقى كل لوحة على وجه التحديد نفس المعاملة. فمن الممكن لقياس OD 600 من كل بئر لتوحيد بالضبط اللقاح البكتيري للخطوة اللاحقة، ولكن هذا ليس لا غنى عنه، ونحن لا نجري مثل هذا الاختيار. نقل 5 ميكرولتر من البكتيريا معلق على لوحات NGM 96-جيدا باستخدام 8 أو 12 قناة متعدد الماصة. يجب الحرص على عدم لمس أو اختراق NGM. يتم تنفيذ هذه الخطوة يدويا، ولكن يمكن أن يكون الأمثل باستخدام الروبوت مثل Liquidator96 (Rainin) التي تسمح للتوزيع الحيوانات المستنسخة رني 96 في خطوة واحدة. السماح للبكتيريا الجافة في إطار مجلس الوزراء رقائقي تدفق العقيمة، والتحقق بشكل منتظم لتجنب NGM تصبح جافة جدا. وينبغي أن تتخذ هذه الخطوة حوالي 2 ساعة. احتضان 96-جيدا رني، NGM لوحات في 37 درجة مئوية يوم في غرفة رطبة. 5. يعد سكان متزامنة من الديدان لهذه الخطوة، ونحن نستخدم الديدان المعدلة وراثيا تحمل جينة مراسل (ق) من اهتمام (مثلا، ص العدوى محرض NLP-29 :: GFP بناء و، باعتبارها الرقابة الداخلية، وبناء ف التأسيسي العقيد-12 :: التحوير dsRed) . بسبب الانخفاض الملحوظ في التعبير التحوير مع الوقت، ونحن ذوبان الجليد دفعات جديدة من الديدان كل 6 أسابيع. الديدان ثقافة نحن لا يقل عن 2 أجيال قبل الاستخدام، والتأكد من أن الديدان لم جوعا قبل الفحص. إذا يوم 2 من البروتوكول هو يوم الثلاثاء، ونحن نستعد الديدان يوم الجمعة من خلال وضع 30 الديدان البالغة الشباب على طبق من ذهب الطول 9 NGM انتشار بكتيريا مع OP50عند 20 درجة مئوية، وهي ستكون مستعدة لتبييض يوم الثلاثاء (انظر الجدول 1). الديدان التبييض بعد بروتوكول معيار 10. السماح لليفقس البيض في M9 في درجة مئوية مع 25 على التحريض للحصول على سكان متزامنة من اليرقات L1. اليوم 3 6. توزيع الديدان على لوحات رني-96-NGM جيد للتغذية ورني وينبغي القيام بهذه الخطوة في الصباح. ويتم توزيع الديدان L1-مرحلة متزامنة على كل نسخة 96-جيدا البكتيرية للتغذية ورني. استرداد 96-جيدا رني، NGM لوحات من 37 درجة مئوية وتركهم في درجة حرارة الغرفة ليبرد. استرداد الديدان المبيض من 25 درجة مئوية. ويقدر عدد الديدان بنسبة 2 ميكرولتر وضبط مع M9 لديها حوالي 100-120 الديدان بنسبة 2 ميكروليتر (قطرة واحدة تقريبا). توزيع يدويا 2 ميكرولتر من L1 المرحلة الديدان في كل بئر باستخدام موزع المتكررة. التحقق من كل جيد للديدان (يجب أن تشاهد الديدان تسبح في السائل). السماح لوحات الجافة في إطار مجلس الوزراء رقائقي تدفق معقم (الحد الأقصى 1 ساعة). تحقق لوحات بانتظام، والديدان ويجب الزحف والسباحة لا. كن حذرا، ويجب أن لا يجف NGM أكثر من اللازم، وإلا فإنه سوف ينهار. وضع لوحات على 25 درجة مئوية في غرفة رطبة. 7. اختبار coniospora جراثيم Drechmeria للعدوى فعال هذه الخطوة هي محددة للشاشة الحالي. وتتكون في اختبار دفعات مختلفة من الجراثيم المسببة للعدوى لتحديد تلك التي للغاية. ولذلك ينبغي أن يتم ذلك في أقرب وقت ممكن قبل يوم 4، ويوم للعدوى. من الضروري أن تعد كافية L3-L4 الديدان مقدما لهذه الاختبارات (الجدول 1). الطرق التفصيلية اللازمة لD. وقد وصفت coniospora ثقافة في مكان آخر 11. <OL> جمع جراثيم من عينة من كل ثقافة فطرية في حجم صغير من M9. ضع قطرة من كل تعليق بوغ على طبق من ذهب NGM 35 ملم مع المصنف OP50، والسماح لها الجافة. إضافة 30-40 L3-L4 الديدان التي تحمل جينات مراسل الفائدة (على سبيل المثال ف NLP-29 :: GFP). وضع لوحات المصابة في درجة مئوية 25 على. اليوم التالي، والتحقق من الديدان لتحريض GFP وحدد مجموعة من الفطريات التي تعطي ألمع، الحث على أوسع نطاق ومتجانسة أكثر من مضان أخضر. اليوم 4 8. تصيب المعرضة رني الديدان مع د. جراثيم coniospora يتم تنفيذ هذه الخطوة بعد 30 ساعة رني تغذية الديدان عندما وصلت إلى مرحلة L3-L4. تحديد حجم جراثيم لاستخدامها لتوزيع 4 ميكرولتر لكل بئر. جمع دال جديدة جراثيم coniospora من الدفعة المختارة مع عازلة M9. استخدم 8-10 مل من M9 واحد لوحة الطول 9 من الجراثيم. <لى> توزيع 4 ميكرولتر من الجراثيم إلى كل جيدا مع موزع المتكررة. التحقق من كل جيدا لجراثيم (يمكنك رؤية الديدان السباحة في السائل). السماح لوحات الجافة في إطار مجلس الوزراء رقائقي تدفق معقم (~ 1 ساعة). تحقق لوحات بانتظام حتى الديدان بدء الزحف. كن حذرا، ويجب أن لا يجف NGM أكثر من اللازم، وإلا فإنه سوف ينهار. وضع لوحات المصابة عند 25 درجة مئوية في غرفة رطبة. 5 أيام 9. مراقبة وتخزين لوحات قبل التحليل الكمي الآلي هذه الخطوة يبدأ 18 ساعة بعد الإصابة، ويتم تنفيذها خلال 5 أيام. ومن المتوقع أن تكون الديدان الشباب انطلاق لوضع البيض. خلال هذه الخطوة يتم تسجيل النمط الظاهري بصريا: إما الديدان يتألق الخضراء والتي تتطابق مع عدوى الوضع الطبيعي بعد، أو يتم تبديل تعريفية لGFP في بئر معين وهذا يعني أن التغيرات الجينية إسكات استجابة للعدوى. <لى> بسرعة مراقبة لوحات تحت المجهر مضان تشريح. إذا كانت لوحات تظهر حسن الاستقراء GFP عام ثم المضي قدما إلى الخطوة التالية، وإلا الانتظار حتى فترة ما بعد الظهر للحصول على أفضل الاستقراء، ما دام لا يزال هناك من المواد الغذائية للديدان. بصريا يسجل كل لوحة وملاحظة أي جيدا مع النمط الظاهري واضح (على سبيل المثال لا تعبيرا عن GFP). عن طريق التحقق من النتائج التي حصل عليها مع أي استنساخ رني التحكم التي تكون قد أضيفت، وهذا أول تحليل أولي يعطي مؤشرا عما إذا كانت التجربة قد حققت نجاحا. باستخدام 8 أو 12 قناة نقل الماصة موضوع الديدان مع 100 ميكرولتر من 50 كلوريد الصوديوم 0.05٪ MM-تريتون، إلى المسمى الجديد في المقابل / barcoded 96-جيدا ذهابا والقاع لوحة. تجميد لوحات على -80 درجة مئوية حتى التحليل. في يوم من التحليل، وذوبان الجليد لوحات في درجة حرارة الغرفة، والشروع في التحليل الآلي باستخدام Biosort COPAS. وفارز يحلل لوحة واحدة في 22 دقيقة. وينبغي أن لا تكون لوحاتترك في درجة حرارة الغرفة لأكثر من ساعة قبل التحليل، وأنها لا يمكن تجميدها مرة أخرى. وكتب على معلومات تم الحصول عليها من Biosort COPAS إلى ملف Excel للتحقق من جودة البيانات خاطفة. ثم يتم تخزين البيانات الأولية مع معلمات مختلفة تقاس Biosort COPAS (الكثافة الضوئية (الانقراض)، وطول محوري (زمن الرحلة)، والانبعاثات مضان، في وقت واحد من ثلاثة أجهزة الكشف عن مختلف) في حزمة LIMS مخصص (MBio LIMS، MODUL- الحيوي) لتحليل كمي مفصل لاحق. 10. ممثل النتائج باستخدام كميات من الديدان والبكتيريا المذكورة أعلاه، في نهاية التجربة، في معظم الآبار، ينبغي أن جميع الحيوانات قد وضعت لمرحلة البلوغ ويجب أن يكون هناك بعض المواد الغذائية لا تزال تترك في جميع الآبار. في ظل هذه الظروف، يجب أن معظم الآبار تحتوي أيضا على البيض. يجب أن يكون هناك عدد كاف من البالغين في كل ذلك أيضا أن يتم الحصول على البيانات و Biosortأو على الأقل 50 الديدان الفردية. من ناحية أخرى، إذا كان رني تتسم بالكفاءة، وعدد كبير من الحيوانات المستنسخة رني إثارة النمط الظاهري مرئية. على سبيل المثال، قد تكون غير منسقة والديدان، أو بوضوح أكثر، عقيم، أو ألقي القبض عليهم في تنميتها. وينبغي أن يحدث هذا في كثير من الأحيان، بحيث عموما واحد على الأقل بشكل جيد في 96-جيدا لوحة تحتوي على ديدان مع النمط الظاهري رني واضح. عندما النمط الظاهري للاهتمام هو التعبير عن الجينات مراسل GFP والآبار مع استنساخ (رني) GFP توفير سيطرة قوية (الشكل 2). ويمكن الظواهر الأخرى، مثل تغيير حجم يقاس بسهولة مع Biosort (الشكل 3A). لاحظنا أن الديدان يمكن أن تهاجر إلى الآبار المجاورة في التردد المنخفض جدا (<1٪، بكالوريوس علوم، ونتائج غير منشورة) عندما لم تشغيل المواد الغذائية في بئر خارج. ويمكن اسقاط وظيفة من فئات مختلفة من الجينات تؤثر على الجينات المحورة التعبير في C. ايليجانس. وبعضها غير مطلوب على وجه التحديد للتعبير الجينات المحورة 12. آخرون، مثلكما عوامل النسخ الأنسجة محددة، وعلى سبيل المثال أن يطلب من عامل غاتا البشرة ELT-3 13، في مجموعات فرعية معينة من الخلايا. هذا هو واحد من الأسباب التي أدت إلى إدراج غير ذات الصلة، والتأسيسية البشرة التركيبة الخلية مراسل التحوير (ع العقيد-12 :: dsRed) في السلالة المستخدمة في بروتوكول الحالي. وهذا يسمح لمثل هذه الجينات يمكن تمييزها من المتورطين وتحديدا في عملية الجينات التنظيمية قيد الدراسة (الشكل 3B & C). يتم التعبير عن هذا التحوير خلال جميع مراحل اليرقات. وإذا كان ينطوي على فحص الكشف عن التعبير الجيني في الأجنة تكون هناك حاجة لمراسل مراقبة مختلف الجينات. واحدة من الابتكارات من هذا البروتوكول هو استخدام لوحات تجميد تأجيل تحليلهم. تجميد يسمح تخزين لوحات لمدة تصل إلى أسبوعين دون تغيير كبير في النتائج. على الرغم من أن قد يتم تغيير القيم المطلقة من مضان يقاس، ونسب النسبية لا تزال مماثلة (الشكل 4). على بعد التمديديدها، رني هو المتغير جوهريا 14 إجراء التجارب. للحصول على نتائج قوية، والقضاء على الكثير من ايجابيات كاذبة المحتملة، وشاشات رني حاجة إلى تكراره، على الأقل مرة واحدة. إذا أجرت بنجاح تجارب، يجب أن يكون هناك ترابط معقول بين نتائج من واحد لوحة اختبار في أيام مختلفة. خاصة، ينبغي أن الجينات التي يكون لها تأثير قوي يمكن التعرف بشكل واضح، حتى لو كان تأثيرها كمي دقيق ليست متطابقة بين لوحات مكررة (الشكل 5). الشكل 1. الخطة الشاملة لتجربة نموذجية. الشكل 2. تحكم رني باستخدام استنساخ تستهدف التعبير GFP. المعدلة وراثيا الديدان expressiتصور نانوغرام constitutively ا ف ب العقيد-12 :: المراسل dsRed ومحرض ص 29 البرمجة اللغوية العصبية :: GFP صحافي في المتوسط ​​الصلبة في لوحة 96-جيدا باستخدام GFP تشريح المجهر مع مجموعة المراقبة السماح للمرشح في وقت واحد من مضان أحمر وأخضر. تعرضوا للسيطرة على الديدان (لوحات العلوي) أو رني GFP استنساخ (لوحات أسفل) لمدة 48 ساعة. لوحات على اليسار هي ديدان غير مصاب، تلك التي على الديدان حق 18 ساعة بعد الإصابة مع د. coniospora. شريط التقييم يكون من 1 ملم. الشكل 3. التحليل الكمي من لوحة 96-جيدا. وBiosort COPAS يولد البيانات الرقمية لكل دودة تحليلها. الرسوم البيانية تظهر الانحراف المتوسط، ومعيار للمرة للرحلة (TOF، A) والتي تتطابق مع حجم الديدان 15، أحمر مضان (B) ونسبة (X100) من مضان أخضر لTOF (ج) من التعليم الجامعي المعدلة وراثياRMS معربا عن constitutively ا ف ب العقيد-12 :: المراسل dsRed ومحرض ص 29 البرمجة اللغوية العصبية :: GFP صحافي انه تم زرعها على وسط الصلبة في لوحة 96-جيدا مع الحيوانات المستنسخة رني مختلفة لمدة 48 ساعة، 18 ساعة بعد الإصابة مع د. coniospora. بعض الحيوانات المستنسخة، مثل تلك التي أبرزت مع السهم في (أ) يؤثر على نمو العيوب استفزاز و / أو، والتعبير عن P-12 :: العقيد dsRed. الآخرين، وتؤثر على وجه التحديد GFP التعبير، والتي أبرزها سهم في (C). هذه نسخة خاصة تستهدف nsy الجينات 1، أظهرت في وقت سابق إلى أن تكون مهمة لتنظيم البرمجة اللغوية العصبية 29 13. ويتم قياس الأخضر والأحمر ومضان TOF في وحدات التعسفي ولكن ثابتة. الشكل 4. شركاتاريسون من البيانات التي تم الحصول عليها مع العينات الحية والمجمدة من نفس التجربة. كانت مصابة اما لوحات من L4 الديدان تحمل ف NLP-29 :: GFP و ف العقيد-12 :: الجينات المحورة dsRed مع د. coniospora أم لا. بعد 18H، قسمت تقريبا كل لوحة في (2)؛ جرى تحليل 1/2 على الفور وتجميد نصف العام في -80 درجة مئوية ل24H، قبل ذوبان الجليد وتحليلها. وحسبت قيم TOF متوسط ​​(حجم الديدان)، تحويلة (الكثافة البصرية)، والأخضر والأحمر مضان لكل عينة. ويبين الرسم البياني نسبة متوسط ​​للإصابة مقسوما غير مصابة العينات، لالعينات المجمدة والحية (ن = 7638 و 5096، و 8634 و 3850 والديدان، على التوالي). الشكل 5. تحليل مقارن لوحات 96-جيدا مكررة. نسبة مضان تطبيع (نسبة مضان يعني (هنا، 100 * أخضر / TOF) لتقسيم جيد من قبل كلوقلص (25 إلى 75 في المئين الخامس والعشرون) يعني لكل لوحة) لكل بئر من تحليلات مكررة ممثل جيد 96 لوحة. مادة التسلسل الزمني التجريبي IPTG: ~ 1،4 مل الأمبيسيلين: ~ 5 مل Tetracyclin: ~ 5 مل LB: 5 L 96-جيدا لوحات مسطحة: 30 لNGM 96-جيدا لوحات جولة: 30 لتجميدها (تحليل) 96-DeepWell لوحات: 30 لعن ثقافة فيلم ثقافة: 30 نصائح مربع: 30 للزراعة البكتيريا 9 سم OP50 لوحات: ~ 17 الديدان: 1 إذابة حديثا cyrovial شهريا الجراثيم: ~ 2 لوحات كلوريد الصوديوم 50mM + 0.05٪ تريتون: ~ 300 مل الخميس إعداد لوحات رني NGM 96-جيدا (~ 1H + الأوتوكلاف) الجمعة إعداد لوحات LB 96-DeepWell (~ 4H) تعد الديدان (14 لوحات مع 30 الديدان البالغة الشباب عند 20 درجة مئوية + 1 لوحة عند 25 درجة مئوية) يوم الاثنين نقل الديدان من لوحة في 25 درجة مئوية على لوحة جديدة توزيع البكتيريا في لوحات LB (~ 7H) عن ثقافة الساعة 6 مساء الثلاثاء توزيع البكتيريا على لوحات NGM في الصباح (~ 3H+ ~ 2H التجفيف) تبييض الديدان من لوحات في 20 درجة مئوية الأربعاء توزيع الديدان في 10 بالتوقيت المحلي (~ 1H + 1H التجفيف ~) جراثيم اختبار مع الديدان من لوحة عند 25 درجة مئوية الخميس تصيب الديدان في 03:00 (~ ~ 1H + 1H التجفيف) الجمعة نقل جديدة في 96-جيدا لوحات + تجميد (~ 2H) الجدول رقم 1. مثال لتجربة واحدة مع 30 دورة لوحات. ويرد هنا على المواد اللازمة لإجراء تجربة واحدة من 30 دورة لوحات والخط الزمني للتجربة من الخطوة 1 إلى الخطوة 12 نظمت في 9 أيام. وسائط النمو الخيطية (NGM)، 100 مل: 0.3 غ كلوريد الصوديوم 0،25 غرام BactoPeptone 2 غرام BactoAgar 100 ميكرولتر 5 مغ / مل في نسبة الكولسترول في الدم EtOH يضاف الماء منزوع الأيونات إلى 100 مل الأوتوكلاف لمدة 5 دقائق على درجة حرارة 121 مئوية والسماح لتبرد، ثم تضيف: 100 ميكرولتر 1 M MgSO 4 100 ميكرولتر 1 م 2 CaCl 2.5 مل 1 م 6،0 درجة الحموضة KPO 4 NGM لتلقي العلاج في لوحة رني 96-جيدا، 100 مل: 0،29 غرام كلوريد الصوديوم 0،25 غرام BactoPeptone 1،7 ز BactoAgar 100 ميكرولتر 5 مغ / مل في نسبة الكولسترول في الدم EtOH إضافة دي مؤين الماء إلى 100 مل الأوتوكلاف لمدة 5 دقائق على درجة حرارة 121 مئوية والسماح لتبرد، ثم تضيف: 100 ميكرولتر 1 M MgSO 4 100 ميكرولتر 1 م 2 CaCl 2.5 مل 1 م 6،0 درجة الحموضة KPO 4 400 ميكرولتر 1 M IPTG 100 ميكرولتر 100 ملغ / مل أمبيسيلين 100 ميكرولتر 12.5 ملغ / مل التتراسايكلين حل التبييض، 5mL: 2.5 مل H 2 O 2.3 مل بليتش 0.2 مل هيدروكسيد الصوديوم 50٪ هيدروكسيد الصوديوم 50٪، 100 مل: 50 غ من هيدروكسيد الصوديوم يضاف الماء منزوع الأيونات إلى 100 مل كلوريد الصوديوم 50mM-تريتون 0.05٪، 400 مل: 4 مل كلوريد الصوديوم 5 M 1 مل تريتون 20٪ يضاف الماء منزوع الأيونات إلى 400 مل TEP "> تريتون 20٪، 10 مل: 2 مل تريتون X-100 8 مل ماء منزوع الأيونات M9 العازلة، 1L 6 غرام نا 2 هبو 4 (MW: 178) 3 غ KH 2 PO 4 (MW: 136) 5 غم كلوريد الصوديوم يضاف الماء منزوع الأيونات إلى 1 L الأوتوكلاف إضافة 1 مل MgSO 4 1 M حساء لوريا (LB)، 1L: 10 ز BactoTryptone 20 مستخلص الخميرة ز 10 جم كلوريد الصوديوم يضاف الماء منزوع الأيونات إلى 1 L الأوتوكلاف 1 M MgSO 4، 300 مل: ز 73.95 MgSO 4 يضاف الماء منزوع الأيونات إلى 300 مل الأوتوكلاف وتخزينها في درجة حرارة الغرفة 5 ملغ / مل من الكولسترول، 200 مل: 1 غرام الكولسترول إضافة 100 EtOH٪ لتصل إلى 200 مل تصفية تعقيم وتخزين في درجة حرارة الغرفة 1 M CaCl 2، 500 مل: 27.75 غ CaCl 2 يضاف الماء منزوع الأيونات إلى 500 مل تصفية تعقيم وتخزين في درجة حرارة الغرفة 1 M KPO 4 درجة الحموضة 6.0، 4 L: 517 ز KH 2 PO 4 (MW: 136) 207 ز ك 2 هبو 4 (MW: 174) يضاف الماء منزوع الأيونات إلى 4 L 100 ملغ / مل أمبيسيلين (الأمبير)، و 10 مل: 1 غرام أمبيسيلين يضاف الماء منزوع الأيونات إلى 10 مل متجر في -20 درجة مئوية 1 الآيزوبروبيل M β-D-Thiogalactopyranoside (IPTG)، و 10 مل: 2،38 ز IPTG يضاف الماء منزوع الأيونات إلى 10 مل متجر في -20 درجة مئوية 12.5 ملغ / مل التتراسايكلين، 100 مل 1،25 ز التتراسايكلين إضافة 100 EtOH٪ لتصل إلى 100 مل الجدول 2. حلول.

Discussion

<p class="jove_content"> البروتوكول الحالي يسمح على نطاق واسع في فحص رني<em> C. ايليجانس</em> على وسائط صلبة، وذلك باستخدام مستوى التعبير عن الجينات مراسل الفلورسنت بوصفها قراءة خارج. وقد الأمثل مع الأدوات الآلية لتسهيل الإنتاجية العالية المقايسات، مما يتيح التعامل مع سهلة وسريعة لأعداد كبيرة من العينات، وبطريقة فعالة وموثوق بها وقابلة للتكرار. وقد وصفت وسائل أخرى لا تعتمد بدرجة كبيرة على التعامل مع الآلية عينة السائل⁸.</p><p class="jove_content"> وكان أحد الجوانب التنظيمية الرئيسية في البروتوكول على تطوير أسلوب قوي من تتبع عينة من خلال تكييف البرامج MBioLIMS التجارية لإجراء شاشة رني بالتعاون مع شركة ModulBio. في كل مرحلة من مراحل الدعوى، ويتم تحديد الآن لوحات بواسطة الباركود ولدت في LIMS. كما LIMS يسجل أيضا هوية من الحيوانات المستنسخة في كل بئر على كل صفيحة، والانتقال من جيد لجينة المفترضة بسيط. وأبعد من ذلك، فإن الروابط LIMS للمجتمع WormBase قاعدة البيانات، مما يتيح الوصول المباشر إلى البيانات الجزيئية والوظيفية عن أي جينة معينة. وLIMS يسهل أيضا على أن تجرى التحاليل على لوحة أو حتى مستوى كروموسوم وكامل الجينوم. لهذه التحليلات، يتم تخزين البيانات بطريقة متوافق تماما مع الأدوات التي سبق وصفها مثل COPAmulti¹⁶.</p><p class="jove_content"> نقطة واحدة تجريبية حاسمة في الأسلوب هو تعديل لكمية من المواد الغذائية بالنسبة لعدد من الديدان. لفحوصات كثيرة، فمن الضروري أن الديدان لا يتضورون جوعا في نهاية التجربة ولكن من المهم أيضا ليس لديهم الكثير من الطعام في البداية. وقد لاحظنا أن كثافة عالية من المواد الغذائية يقلل الاستقراء مضان في البروتوكول باستخدام الديدان التي تحمل ف<em> البرمجة اللغوية العصبية-29</em> :: المراسل GFP. وهذا قد يعكس كفاءة عدوى تقلص عندما يتم زرعها في البكتيريا والديدان أكثر من اللازم (BS، ونتائج غير منشورة). في الوقت نفسه، فإن ظروف ثقافة من البكتيريا رني مهم أيضا، لأن هذا يحدد ما إذا كان يتم إنتاج الرنا المزدوج الجديلة على المستوى الأمثل. بعض البروتوكولات على نطاق واسع رني تتطلب ثقافة من الحيوانات المستنسخة رني على لوحات أجار قبل البذر الثقافات السائل⁸. حصلنا على قوة إسكات الجينات بحذف هذه الخطوة. اخترنا لزراعة وجود فائض من كل ثقافة لضمان تحقيق نتائج متجانسة. البروتوكول هو موضح في واقع الأمر يوفر مادة كافية لإجراء أو 2 أو 3 شاشات في نفس الوقت. لمصلحة من الحصول على نتائج أقوى، نؤيد، ولكن، وإجراء الشاشات في تكرار استخدام الثقافات مستقل من الديدان والبكتيريا والجراثيم الفطرية رني.</p><p class="jove_content"ويرتبط> آخر خطوة حاسمة لاستخدام المتوسطة التي ليست رطبة جدا ولا جافة جدا. إذا كانت لوحات ليست جافة بدرجة كافية، والبكتيريا رني لا يجف بشكل سليم والديدان والسباحة خلال الفحص. وهذا يمكن أن يسبب مشاكل. على سبيل المثال، لا يتم الديدان المصابة بكفاءة<em> د. coniospora</em> في السائل (جيم Couillault، ونتائج غير منشورة). من ناحية أخرى، في لوحات الجافة، والأسمولية من الزيادات الثقافة المتوسطة. هذا له آثار مباشرة في علم وظائف الأعضاء دودة¹⁷، بما في ذلك تحريض بعض الجينات المضادة للجراثيم الببتيد، مثل<em> البرمجة اللغوية العصبية 29</em>¹⁸. حجم المستخدمة في الاستغناء الديدان والجراثيم ضروري للسماح للتجفيف فعالة وسريعة. إذا تم إضافة أكثر من 10 ميكرولتر من السائل لوحات جديدة، لا يمكن للآبار يستغرق عدة ساعات لتجف. وهذا يمكن أن يعني أنه من الصعب استخدام وسائل آلية لإضافة إلى لوحات والديدان. على سبيل المثال، تم الاستغناء عن كل دودة من قبل Biosort في حوالي 1 ميكرولتر من السائل. نوزع حاليا على الديدان يدويا كما أن يسمح لنا أيضا للتغلب على ميل من الديدان في حل الرواسب.</p><p class="jove_content"> نحن عنها سابقا تعديلا للBiosort التي سمحت لتحليلها 1 96-جيدا لوحة في 36 دقيقة¹⁹. يو بي آي الآلة الصانع يقدم الآن على تعديل لBiosort إلى مزيد من الانخفاض في الوقت تحليل. مع "FastReFlex"، يتم توجيه عينات مباشرة من خلال خلية تدفق للتحليل، تجاوز مرشح فقاعة فخ. وهذا يؤدي إلى خفض كبير في الوقت للحصول على البيانات، ويمكن تحليلها لوحة كاملة في 22 دقيقة مما يتيح حوالي 20 لوحات في أن يعامل في اليوم الواحد. اذا لم يتم تجميدها لوحات، ولكن، لن يكون هناك فاصل زمني بين 8 ساعات منها الأول والأخير. نظرا لفترة قصيرة نسبيا من هذه التجربة، مع الإصابة استمرت 18 ساعة فقط، هذا من شأنه أن يعرض متغير غير مقبول عبر لوحات. ليس فقط لا لوحات تجميد قبل تحليل لحل هذه المشكلة، ولكن من الضروري أيضا في سياق عالية الإنتاجية كما تحليلات، مع البروتوكول الحالي ومستوى الروبوتات سائل مناولة (2)، يمكن للناس بسهولة معالجة ما يصل إلى 50 لوحات في الأسبوع. حاليا، نحن الشاشة بشكل روتيني 30 لوحات في الأسبوع، والذي يسمح للشاشة كامل الجينومتجرى مرة واحدة في أقل من 2 أشهر.</p><p class="jove_content"> واحد ميزة مثيرة للاهتمام من هذا البروتوكول هو حقيقة أنه يستخدم أجار الصلبة، مما يسمح للفحوصات التي لا يمكن أن يؤديها في ثقافة السائل. كما علم وظائف الأعضاء دودة يختلف تبعا للظروف ثقافة^20،21، كونه قادرا على أداء فحوصات على المتوسط ​​الصلبة يمكن أن تكمل أيضا المعتادة السائل القائم على الشاشات. عن الظواهر معينة (مثل الحركة)، ويمكن إجراء تحليل خارج مباشرة مع لوحات متوسطة 96-جيد الصلبة. للشاشة الحالية، ولكن، كما Biosort لا يمكن أخذ عينات من لوحات متوسطة الصلبة، ويتم نقلها إلى 1 الديدان السائلة قبل التجميد. من ناحية أخرى، فإن Biosort COPAS يسمح التحليل الكمي multiparametric متوافق مع قياس الظواهر المختلفة. فمن المرجح أن أي شاشة لا تعطى جميع المعلمات يقاس ستكون الأولية للقراءة خارج. ومع ذلك، يمكن لهذه القياسات تكون مفيدة لعدة أسباب. فهي تسمح واحد لتحديد ما إذا كان فحص ركض بشكل صحيح. على سبيل المثال، يمكن للمرء أن تحقق في عدد وحجم من الديدان في كل بئر. حيث يجب أن مجرد استنساخ رني يجب منع نمو أو الاستنساخ أن يكون هناك انحراف عن القيم المتوقعة. الآبار مع أقل من 20 الديدان و / أو الحيوانات 30٪ أصغر (TOF) مقارنة مع ستانالمعيارية تحكم بما لا يؤثر على نمو (<em> على سبيل المثال GFP ([رني</emويمكن استبعاد>)) من تحليلات لاحقة. ويمكن معالجة وظيفة من هذه الحيوانات المستنسخة باستخدام بروتوكول بديل حيث يتعرضون للبكتيريا والديدان رني بعد تنميتها هو مرحلة متقدمة¹⁵. ويمكن أيضا أن معايير مختلفة يمكن استخدامها لتحسين الجينات مرشح (هيت) اختيار، على سبيل المثال، مما يحد من الفعالية الوحيدة لتلك التي تؤثر مضان أخضر أحمر ولكن لا. إن أسلوب اختيار دقيق لاختيار الفعالية تعتمد على نوع من الشاشة والدقيق تلا. نظرا لتعقيد البيانات التي تم إنشاؤها من شاشة الجينوم على نطاق كمي، قد يكون مطلوبا بالتعاون مع الاحصاء.</p><p class="jove_content"> سيكون هذا البروتوكول وصفنا تتكيف بسهولة إلى أنواع أخرى من المقايسات. على سبيل المثال، في خطوة عدوى<em> د. coniospora</em> يمكن الاستعاضة عن أي مسببات الأمراض الأخرى قادرة على إصابة على وسائل الاعلام الصلبة. هذا يمكن أن تكون مفيدة إذ أننا وجدنا أن العديد من عوامل الفوعة هامة للعدوى الذابلة السراتية في ثقافة السائل لا تلعب دورا في الإصابة في المتوسط ​​الصلبة (E. Pradel، اتصال شخصي). البروتوكول هو أيضا متوافقة تماما مع اختبارات من المركبات الكيميائية^22-24، أو لتحديد المركبات ذات النشاط الحيوي باستخدام مكتبات مختلفة من البكتيريا²⁵، وينبغي لذلك تجد فائدة العامة في<em> C. ايليجانس</em> المجتمع البحثي.</p

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments
BactoAgar	BD Diagnostic Systems	214010
Ampicillin	Sigma-Aldrich	A9518
BactoPeptone	BD Diagnostic Systems	211677
CaCl2	Any supplier
AeraSeal adhesive film	Dutscher	760214
Isopropyl β-d-Thiogalactopyranoside (IPTG)	Thermo Scientific	AB-0481
K2HPO4	Any supplier
KH2PO4	Any supplier
MgSO4	Any supplier
NaCl	Any supplier
Na2HPO4	Any supplier
NaOH	Any supplier
96 deep well plate	Thermo Scientific	AB-0932
96 well flat plate	FALCON	353072
96 well round plate	FALCON	353077
Tetracycline	Sigma-Aldrich	T8032
Triton X-100	Any supplier
TECAN robot	TECAN
Liquidator96TM	RAININ
COPAS Biosort	Union Biometrica
LIMS	Modul-Bio