Vi beskriver en metode til at kombinere automatiseret celle dyrkning med høj-indhold billeddannelse til at visualisere og kvantificere flere cellulære processer og strukturer, i en høj-throughput måde. Sådanne metoder kan hjælpe i den videre funktionelle annotation af genomer samt identificere sygdomsgenet netværk og potentielle lægemiddelkandidater.
Den funktionelle annotation af genomer, opførelse af molekylære netværk og nye lægemiddel target identifikation, er vigtige udfordringer, som skal løses som et meget presserende 1-4. Flere komplementære 'omik tilgange har givet fingerpeg om den genetiske risikofaktorer og patogene mekanismer bag talrige neurodegenerative sygdomme, men de fleste fund stadig kræver en funktionel validering 5. For eksempel er en nylig genom bred forening undersøgelse for Parkinsons sygdom (PD), identificeret mange nye loci som risikofaktorer for sygdommen, men den underliggende sygdomsfremkaldende variant (er) eller sygdomsfremkaldende mekanisme ikke er kendt 6, 7. Da hver associeret regionen kan indeholde flere gener, ville den funktionelle evaluering af hver af de gener på fænotyper forbundet med sygdommen, ved hjælp af traditionelle cellebiologi teknikker tager for lang tid.
Der er også behov for at forstå de molekylære netværk, der forbindergenetiske mutationer til fænotyper de forårsager. Det forventes, at sygdommen fænotyper er resultatet af flere interaktioner, der er blevet forstyrret. Rekonstruktion af disse netværk ved hjælp af traditionelle molekylære metoder ville være tidskrævende. Desuden vil netværket forudsigelser fra uafhængige undersøgelser af de enkelte komponenter, reduktionisme tilgang, sandsynligvis undervurderer kompleksitet i nettet 8. Denne undervurdering kan til dels forklare den lave succesrate for godkendelse af lægemidlet på grund af uønskede eller toksiske bivirkninger. Opnåelse af et netværk perspektiv af sygdomsrelaterede veje ved hjælp af HT / HC cellulære screening nærmer sig, og påpege de vigtigste knudepunkter inden for disse veje, kan føre til identifikation af mål, der er mere egnet til terapeutisk intervention.
High-throughput screening (HTS) er en ideel metode til at løse disse spørgsmål 9-12. men traditionelle metoder blev endimensionale hel-såvel celle assays, der anvendes forenklingSTIC aflæsninger for komplekse biologiske processer. De var ude af stand til samtidigt at kvantificere de mange fænotyper observeret i neurodegenerative sygdomme såsom aksonal transport underskud eller ændringer i morfologi egenskaber 13, 14. Denne fremgangsmåde kunne ikke bruges til at undersøge den dynamiske karakter af cellulære processer eller sygdomsfremkaldende hændelser, der opstår i en delmængde af celler. For at kvantificere sådanne funktioner man skal flytte til multi-dimensional fænotyper betegnes høj-indhold screening (HCS) 4, 15-17. HCS er den celle-baserede kvantificering af flere processer samtidigt, hvilket giver en mere detaljeret fremstilling af det cellulære reaktion på forskellige forstyrrelser i forhold til HTS.
HCS har mange fordele frem for HTS 18, 19, men at gennemføre en high-throughput (HT)-højt-indhold (HC) skærmen i neuronal modeller er problematisk på grund af høje omkostninger, miljømæssige variation og menneskelige fejl. For at afsløre cellulære svar på en "phenomics 'skalaved hjælp af HC billeddannelse man nødt til at reducere variation og fejl, og samtidig øge følsomhed og reproducerbarhed.
Heri vi beskriver en metode til præcist og pålideligt gennemføre shRNA skærme ved hjælp af automatiserede celle dyrkning 20 og HC billeddannelse i neuronal cellulære modeller. Vi beskriver, hvordan vi har brugt denne metode til at identificere modulatorer for et bestemt protein, DJ1, som når muteret forårsager autosomal recessive parkinsonisme 21.
Ved at kombinere den alsidighed af HC billeddannelse med HT metoder, er det muligt præcist at kvantificere en overflod af fænotyper. Dette kan efterfølgende bruges til at fremme vores forståelse af genomet, de veje der er involveret i sygdommen patogenese samt identificere potentielle terapeutiske mål.
Med de faldende omkostninger af HT / HC cellulære screening-systemer, kombineret med tilgængeligheden af kraftfulde genom-dækkende værktøjer til at ændre genfunktion, er HT / HC skærme bliver hverdagskost i den akademiske verden. Den fremgangsmåde er allerede blevet anvendt med succes til forskellige forskningsområder såsom identifikation af lægemiddelkandidater inden for kræft 9, 31-33 og embryonale udvikling 34-36 og endda har potentiale til anvendelse i decifrere de veje, der er involveret i neuropsykiatriske lidelser 37,38. Men gennemførelsen af et sådant system kræver en betydelig investering af tid og kræfter med procesoptimering ofte tager mindst 6 måneder. Alle trin, såsom trypsinization gange, pipettering hastigheder og såning tætheder må justeres, for at sikre, at cellerne er sunde og vokse konsekvent. Forebyggelse af bakteriel forurening er en af de vanskeligste udfordringer automatiseret cellekultur med ugentlig rengøring protokoller i Combination med konstant skylning af alle flydende pejlelinjer med 70% ethanol er nødvendigt for forurening gratis kulturer. Det vil også være nødvendigt at forbedre robotteknologi, således at yderligere instrumenter såsom konfokal mikroskoper til højere opløsning og -80 ° C frysere for sammensatte opbevaring kan integreres.
Der er også begrænsninger, der skal løses for at forbedre den følsomme, hastighed og anvendeligheden af denne metode til at studere gen-netværk og identificere gener involveret i sygdomsfremkaldende molekylære veje.
At gennemføre en HT / HC skærmen og sikre, at pålidelige data indsamles, flere aspekter skal optimeres. Første, pålideligheden af målingen er altafgørende, og er afhængig af robusthed og følsomhed af analysen. For eksempel er de analyser, der er beskrevet ovenfor, velegnet til mindre skærme, men er vanskelige at gennemføre på et genom bred skala, på grund af antallet behandling nødvendige skridt til, før billedet overtagelsen.Således ville man være nødt til at konstruere stabile cellelinier der udtrykker reporter genet, hvilket vil give mulighed for direkte billedbehandling og føre til nedsat variation som følge af den reducerede antallet af behandlinger trin. På nuværende tidspunkt, at designe et forsøg, der præcist afbilder og pålideligt kvantificerer en fænotype af interesse er en stor flaskehals i HC screening proces.
Mange skærme er udført i mammale celler ved hjælp af forskellige RNAi biblioteker, som alle lider af ikke-tilsigtede effekter, begrænset gen silencing effektivitet og ufuldstændig genom dækning. Således biblioteker skal gøres, som er mere specifikke, potent og har bedre dækning. Gøres en indsats for at skabe sådanne Det er håbet sådanne bestræbelser vil forbedre reproducerbarheden af HT / HC scre EN hits.
En begrænsning af de mange store celle baserede skærme er, at de er gennemført i neuroblastomceller fordi de kan være genetisk manipuleret og kulturperler til store numre med relativ lethed. Men relevansen af 'hits' identificeret i ex vivo cellekulturer modeller til in vivo-funktionen er tvivlsom, især da hjernen består af højt specialiserede celletyper, der danner en tæt og kompliceret netværk af synaptiske forbindelser til fungere som en stærkt integreret enhed. Som følge heraf er det almindeligt, at rammer er identificeret ved hjælp af screening metode der er beskrevet ovenfor, er valideret i sekundære skærme ved hjælp af yderligere teknikker og i mere fysiologisk relevante modeller 39. For at forbedre oversættelsen af hits identificeret under HCS, mere repræsentative og avancerede modeller, som f.eks primærelementer og differentierede stamceller eller co-kultur systemer skal udvikles og tilpasses til HT / HC tilgange.
ntent "> Med en kombination af automatiserede celle dyrkning og HC billedbehandling kan man hurtigt få ny indsigt i, hvordan neuroner funktion og afgøre, hvilke veje der er vigtige for udvikling af sygdom. kombinere HCS / HTS-data med oplysninger, der genereres fra andre 'omik tilgange, det vil så være muligt at konstruere en systembiologi overblik over hjernens sygdomme, hvilket vil lette terapeutisk udvikling.The authors have nothing to disclose.
Vi takker Hamilton programmører og specialister til fortsat støtte og Eva Blaas til teknisk bistand. Dette arbejde blev støttet af to NWO Investeringstilskud (911-07-031 og 40-00506-98-10011), The Prinses Beatrix Fonds Wetenschapsprijs 2009 og Neuroscience Campus Amsterdam SJ er støttet af Ti-Pharma: T5-207.
Name of reagent | Company | Catalogue Number |
AI.CELLHOST | HAMILTON | http://www.hamiltonrobotics.com/en-uk/applications/cellomics/ |
OPTI-MEM | INVITROGEN | 31985-054 |
RETINOIC ACID | SIGMA-ALDRICH | R2625 |
OMNITRAY PLATES | NUNC | 465219 |
96 WELL CULTURE PLATES | GRENIER | 655086 |
DJ1 N20 ANTIBODY | SANTA CRUZ | SC27004 |
BETA-III TUBULIN ANTIBODY | SIGMA-ALDRICH | T3952 |
MITOTRACKER CMXROS | INVITROGEN | M-7512 |
HOECHST-33342 | INVITROGEN | H1399 |
HYDROGEN PEROXIDE | SIGMA-ALDRICH | 216763-100ML |
TRYPSIN | INVITROGEN | 25050014 |
DULBECCO’S PHOSPHATE BUFFERED SALINE | INVITROGEN | 14190086 |
PROMEGA WIZARD MAGNESIL TFX | PROMEGA | A2380 |
SHRNA CLONES | OPEN BIOSYSTEMS | http://www.openbiosystems.com/RNAi/shRNALibraries/ TRCLibraryDetails/ |
CELLOMICS BIOAPPLICATIONS | THERMO-FISHER | http://www.thermo.com/hcs |