Elektrofysiologiske Karakterisering af GFP-udtrykkende cellepopulationer i den intakte Retina

Summary

Denne artikel viser optagelsen af ​​de enkelte celler fra fluorescens tagget neuronale populationer i det intakte mus nethinden. Ved at bruge to-foton infrarøde excitation transgenetically mærkede celler var målrettet til patch-clamp-optagelse for at studere deres lette svar, modtagelige feltegenskaber, og morfologi.

Abstract

Undersøgelse af fysiologiske egenskaber og synaptiske forbindelser af specifikke neuroner i den intakte væv er en udfordring for de celler, der mangler synlige morfologiske træk eller vise en lav befolkningstæthed. Dette gælder især for retinal amacrine celler, en usædvanlig mangeartet klasse af interneuroner, der udgør omkring 30 undertyper i pattedyr ^1. Skønt at være en afgørende del af den visuelle behandling af forme retinale udgang ^2, har de fleste af disse undertyper ikke blevet undersøgt indtil nu i en funktionel sammenhæng, fordi støder på disse celler med en optagelse elektrode er en sjælden begivenhed.

For nylig, et væld af transgene mus linjer er til rådighed, der udtrykker fluorescerende markører som grønt fluorescerende protein (GFP) under kontrol af initiativtagerne til membran receptorer eller enzymer, som er specifikke for kun en delmængde af neuroner i et givet væv ^3,4. Disse pre-mærkede celler er derfor accessible til instrueret mikroelektrode målrette under mikroskopiske kontrol, således at den systematiske undersøgelse af deres fysiologiske egenskaber in situ. Imidlertid er excitation af fluorescerende markører ledsaget af risikoen for fototoxicitet for det levende væv. I nethinden, er denne tilgang yderligere vanskeliggjort af det problem, at excitation lys forårsager passende stimulering af fotoceller, således at påføre photopigment blegning og overføre den retinale kredsløb i et let-tilpasset tilstand. Disse ulemper er overvundet ved hjælp af infrarød excitation leveret af en mode-locked laser i korte pulser af femtosekund rækkevidde. To-foton excitation giver energi nok til fluoroforen excitation og samtidig begrænser irritation til et lille væv volumen minimering af farerne af solskader ^5. Også, det forlader nethinden lydhør over for visuelle stimuli siden infrarødt lys (> 850 nm) er kun i ringe grad absorberes af photopigments ^6.

<p class = "jove_content"> I denne artikel vil vi demonstrere brugen af en transgen mus nethinden for at opnå elektrofysiologiske in situ optagelser fra GFP-udtrykkende celler, der visuelt målrettet af to-foton excitation. Nethinden er udarbejdet og vedligeholdes i mørke og kan blive udsat for optisk stimuli som forventes gennem kondensatoren til mikroskop (figur 1). Patch-clamp optagelse af lys reaktioner kan kombineres med farvestof påfyldning at afsløre morfologi og at kontrollere for gap junction-medierede dye kobling til de omkringliggende celler, således at målet celle kan ved studeres på forskellige eksperimentelle niveauer.

Protocol

Følgende beskrivelse forudsætter, at forsøgslederen har en grundlæggende forståelse af retinal struktur, patch-clamp optagelse, og to-foton mikroskopi. For nyttige oplysninger om oprettelse og drift af en patch-clamp setup og to-foton imaging system, se Refs [7-12]. 1. Dyre-og væv forberedelse Hold musen mørk-tilpasset i mindst 3 timer I mellemtiden forbereder 1-2 L af ekstracellulært løsning bestående af (i mm) 125 NaCl, 2,5 KCl, 1 CaCl 2, 1,6 MgCl 2, 25 NaHCO 3, 10 D-glucose og tempereres det til pH 7,4 ved gasning med carbogen (5% CO 2 i O 2) ved stuetemperatur. en Aflive musen i en lufttæt kammer ved CO 2 overdosis fulgt af dislokation af halsen. Denne procedure og de følgende trin skal udføres i mørke. Brug dim lang bølgelængde belysning (vi blokere korte bølgelængder fra en kold lyskilde med en 690 nm-longpass filter) til at understøtte personlige vision og samtidig holde dyrets øjne, mørk-tilpasset (mus kun har dårligt syn i den røde del af lysspektret). For arbejde i fuldstændig mørke bruge infrarød belysning (> 800 nm) og slid natkikkerter. Enucleate øjne med et par af buede iris saks og overføre dem til en parabol af ekstracellulært løsning henført under en dissektionsmikroskop. Fjern hornhinden og corpus ciliare ved at åbne øjet pæren langs ORA serrata (grænsen mellem nethinden og corpus ciliare) med et par af forårets sakse (vi først bruge en lancet til at gennembore et udgangspunkt for skæring). Tag linsen og omhyggeligt adskilt nethinden fra pigment epitel. Hvis orienteringen af ​​nethinden er afgørende for dit studie, viser det ligesom i Ref. [12]. Skær den optiske nerve mellem nethinden og pigment epitel og fjern nethinden fra øjestykket. Bemærk retningen af ​​retinal overflader: indersiden af ​​kruset op nethinden er den ganglion celle side, ydersiden er fotoreceptor side. Tag glaslegemet fra den indre nethinde overfladen ved forsigtigt at trække det ud ved hjælp af en træ-tandstikker. Til dette formål skal du bruge en lille mængde ekstracellulært løsning, der netop dækker nethinden. Den glasagtige klæber til tandstikker og kan trækkes centrifugalt væk fra nethinden. Derefter gælder korte snit langs retinale perimeter at lette udfladning af vævet. Overfør nethinden af ​​kontrolapparatet kammer fotoreceptor nedad, bredte det ud på glasbund (vi bruger en fin pensel) og immobilisere den med en nylon-overspændte stel af rustfrit stål. Forbered den anden nethinden på samme måde, og holde det mørke-tilpasset i carboxygenated ekstracellulære løsning til senere brug. 2. Optagelser Installer optagelsen kammer i mørke under en opretstående laser scanning mikroskop og superfuse den retinale præparatet kontinuerligt (ikke mindre end 5 ml / min) med carboxygenated ekstracellulære løsning opvarmet til 35 ° C. Mikroskopet (også udstyret med en infrarød-følsom CCD-kamera) er beliggende på en stødabsorberende luft bord inde i et Faradays bur for elektronisk afskærmning. Dæk buret med et ikke-transparent gardin til at holde forberedelse i mørket. Vi har også skærmen slukket lyset fra computerskærme med røde gennemsigtig film. Tune den infrarøde laser til 850-870 nm eller længere bølgelængder, skifte til mode-locked stand, og bruge to-foton excitation at visualisere GFP-udtrykkende celler. Dæmpe laser-udgang via neutralfiltre kontrolleret af laser scanning software ned i en grad, der netop er tilstrækkeligt til klar anerkendelse af den fluorescerende cellen For patch-clamp-optagelser i løbende klemme tilstand brug glas mikropipetter (vi bruger borosilikatglas slange på 1,5 mm udvendig diameter og 0,225 mm vægtykkelse) fyldt med intracellulær løsning bestående af (i mm) 125 K-gluconat, 10 KCl, 0,5 EGTA, 10 HEPES, titreret til pH 7,4 med KOH (hvilket giver en pipette modstand på omkring 5 MOhm). Bemærk, at andre eksperimentelle betingelser gerne spændings-clamp optagelse kræver en anden løsning. Hvis farvestoffet injektioner ønskes, tilsættes et fluorescerende probe (vi bruger 10 mM Alexa Fluor 594) eller et sporstof molekyle (3% Neurobiotin). Sæt mikropipette i holderen, og sørg for, at henvisningen elektrode (chlorerede sølv tråd) er i kontakt med den ekstracellulære løsning i optagelsen kammeret. Påfør tryk på mikropipette og målrette en GFP-udtrykkende celler (vi bruger en 40-fold nedsænkning i vand mål; NA 1.25). Amacrine celle organer er beliggende i ganglion cellelag (lige under overfladen i den nuværende retning af nethinden) samt i den proximale del af den indre nukleare lag (ca. 55-75 μm dybt inde i forberedelse). Før mikropipette kontakt med målrettet celle, den indre begrænser membran (en kappe lavet af glial endfeet) på nethindenOverfladen skal være trængt ind. Vellykket penetration af intracellulære løsning, der er drevet ud fra mikropipette spids og løsner den indre begrænser membran fra det underliggende retinal væv som kan iagttages på en infrarød transmission, der optages via IR-CCD-kamera. Approach den ønskede celle ved at sammenligne Soma position fra den to-foton billede med billedet af den IR-CCD-kamera, der viser placeringen af ​​optagelsen mikropipette. Bemærk, at dette skridt ikke opnås nemt og kræver lidt øvelse, fordi den GFP-udtrykkende celler er at blive anerkendt i den infrarøde transmission billedet for at dirigere mikropipette mod det. Korrekt målretning er nået, når mikropipette spidsen årsager indtrækninger af cellens overflade, der kan ses i de to-foton billede. Alternativ til denne procedure, bruge en fluorescerende farvestof (f.eks Alexa Fluor 594, 100 mM) i den intracellulære løsningen til at afsløre mikropipette position i de to-foton billede. To-foton infrarød excitation giver mulighed for tilstrækkelig fluorescens af dette farvestof for at gøre mikropipette mærkbar. Til dette formål, justere detektionsområdet i laser scanning software til også at omfatte rød fluorescens. Slip pres fra mikropipette og få en hel-celle patch-clamp-konfiguration i løbende klemme tilstand. En brugbar optagelse skal give en membran potentiale for -50 til -55 mV og sidste i mindst 20 min. Nuværende visuelle stimuli skabt af en stimulation software (vi bruger QDs af Thomas Euler, University of Tübingen, Tyskland) 11 på en computerskærm. Juster den rumlige position stimulation til at være centreret på de optagede celle: Marker cellen position på skærmen viser transmissionen billede af IR-CCD-kamera og centrum en spot-lignende stimulus på det. Tune stimulus intensiteten ved at indsætte neutralfiltre ind i strålegangen. Til kalibrering af skærm spektrum og intensitet se ref [14]. Vælg et prolonged interstimulus interval (fx 15 s) for at undgå tilpasning. Medtag en fotodiode i strålegangen for opbevaring af stimulus timing. Start stimulering protokollen og registrere lys svarene (vi bruger en samplingfrekvens på 10 kHz med filtrering på 5 kHz for ikke-spiking celler, for spike optagelse af en højere samplingfrekvens som 20 kHz anbefales). Brug lyset stimulation software til at udløse optagelsen software. For farvestof påfyldning lad fluorescerende stof diffunderer ind i indspillet cellen i 30-45 minutter før omhyggeligt hydrauliske mikropipette fra cellen. Pas på ikke at trække sig ud af cellen kroppen. Hvis det ikke-fluorescerende tracer Neurobiotin blev brugt, den har brug for visualisering ved at binde sig til streptavidin konjugeret til et fluoroforen (vi bruger streptavidin-Cy3, 1:400 natten over ved 4 ° C efter 20 min paraformaldehyd fiksering af nethinden, for dye-kobling undersøgelser streptavidin inkubationen kan forlænges til 3 d). Alternativt kan injektioner også udføres medskarpe elektroder (> 100 MOhm), når farvestoffet er drevet iontophoretically i spiddet celle (rektangulære pulser: 0,25-1 NA, 100 ms, interval 100 ms, samlet tid 3-6 min). 3. Repræsentative resultater: Følgende resultater stammer fra en undersøgelse på en mus udtrykker grønt fluorescerende protein (GFP) under promotor for tyrosin hydroxylase 13,14, det enzym, der katalyserer det hastighedsbegrænsende trin i katekolamin syntese (TH:: GFP mus). Baseret på lysstyrken på GFP-signalet to forskellige cellepopulationer kan skelnes fra hinanden (Figur 2A). Celler, der udtrykker det højere GFP-niveau besidder celle, der er beliggende i den indre nukleare lag (INL, figur 2A) eller fordrevne i ganglion cellelag (GCL, figur 2B) og stratificere i midten af ​​den indre plexiform lag (IPL, figur 2C) . De blev identificeret som type 2-celler 14-16 og kunne systematisk undersøgt med hensyn til morfologi (Figur 3) og vælgerrical aktivitet (Figur 4) selv om dens befolkningstæthed kun beløber sig til 250 celler / mm 2. Figur 1. Skematisk fremstilling af forsøgsopstillingen. To-foton excitation (rød stiplet lys sti) for fluoroforen-udtrykkende celler i den intakte nethinden giver visuelle målretning af en mikropipette (grøn emission lys sti). Nethinden er udsat for optisk stimuli projekterede gennem kondensatoren til mikroskop (gult lys sti), og cellulære lette svar er registreret. Figur 2. GFP-udtrykkende celler i en retinal flatmount af en TH:: GFP mus. To populationer kan skelnes ved at lysstyrken på GFP-signal: type 1-celler (DA celler) ligger i INL viser svag fluorescens (A, se pilespidser) og intenst mærkede type 2-cellermed celle organer, enten i INL (A, se pile) eller fordrevne i GCL (B) og en dendritiske lagdeling i stratum S3 af IPL (C). Skala barer, 50 μm. Figur 3. Morfologi af en type 2-celler injiceret med sporstof Neurobiotin. Det sporstof blev efterfølgende visualiseret ved streptavidin-Cy3 bindende (magenta). De mikrograf, som også skildrer GFP signal (grøn), er en projektion af Billedstakke dækker GCL og IPL. Skala bar, 50 μm. Figur 4. Light svar af en type 2-celle placeret i GCL. Reaktionsmønster til hvidt lys fuld-field belysning af stigende intensitet i scotopic området. Stimulus intensitet er givet i photoisomerizations pr stang per sekund (Rh * / stang / s). En forlænget stimulus på 3 s blev brugt til bedre adskillerion af reaktionen komponenter på stimulus debut (ON respons) og offset (OFF respons).

Discussion

Denne metode giver mulighed for at studere elektriske egenskaber af specifikke neuroner i den intakte nethinden under visuel vejledning uden at påvirke tilpasnings tilstand af nethinden. Det er specielt velegnet til karakterisering af celler, der i øjeblikket er temmelig dårligt undersøgt på grund af lav befolkningstæthed som de fleste populationer af amacrine celler. To-foton excitation giver høj opløsning og høj kontrast imaging selv fra dybere dele af vævet ^17, en forudsætning for præcis målretning og vellykket patch-fastspænding af celler især i de INL med sin høje tæthed af celle organer.

Den isolerede musen nethinden er rentabelt for 3-4 timer under eksperimentelle betingelser. Hvis den anden nethinden er gemt i komplet mørke under konstant carbogen gasning, bevarer den lilla farve ubleget photopigment og kan bruges efter endt forsøg med den første nethinden. I begyndelsen, rettet modvalgte celle med mikropipette i retinal wholemount er en smule udfordrende og kræver lidt øvelse, især når der arbejdes i mørke. Herunder et fluorescerende farvestof i mikropipette kan forenkle proceduren, fordi celle og mikropipette er synlige under to-foton excitation på samme tid. Dog kan tilføje komponenter til den intracellulære løsning hindre gigaseal dannelse eller forårsage optagelsen kvalitet til at lide. Når succes opnået, kan en god optagelse, der sidst i ca 1 time

Der henviser til, infrarøde excitation lys i sig selv er kun i ringe grad absorberes af retinal fotoreceptorer, ophidset GFP-udtrykke celler udsender lys i den synlige del af spektret. Dog er fluorophores begejstrede kun i et lille omdrejningspunkt volumen, der ikke er sandsynligt, at ændre tilpasnings tilstand af nethinden. Alle de mere, magnetisering er kun nødvendig for at målrette og kan slukkes under optagelse af lys svar.

Den usefulnESS af denne fremgangsmåde er allerede bevist ved undersøgelser af specifikke populationer af amacrine celler ^14,18 hvorfra elektrofysiologiske optagelser ellers ville have været muligt blot ved et uheld ^12. Endelig kan denne kraftfulde teknik, yderligere udvides ved at inkludere en farmakologisk tilgang ^14, Ca ^{2 +} imaging ¹⁹ eller ved at bruge injiceres celler til immuncytokemiske studier eller elektronmikroskopi. På den måde kan den funktionelle placering af en given celletype i retinale kredsløb blive bragt i orden.

Materials

Reagent/Equip-ment	Company	Catalogue number	Comments
Night-vision goggles	Gutzeit GmbH, Warthausen, Germany	Xtron F1	includes a 800 nm light source
Optical filter	Schott, Mainz, Germany	RG9	longpass filter with cutoff at 690 nm
Iris scissors	Fine Science Tools	14061-09	curved with 22 mm blade
Spring scissors	Fine Science Tools	15000-00	straight with 3 mm blade
Recording chamber	Luigs & Neumann GmbH, Ratingen, Germany	200-100 500 0180 type A(TC)	Teflon chamber with bottom-mounted glass cover slip (approx. 0.15 mm; No. 200-100 500 0182)
Flow heater	Multichannel Systems, Reutlingen, Germany	PH01, TC01	heatable perfusion cannula with temperature sensor and temperature controller
Laser scanning microscope	Leica Microsystems	DM LFS	controlled by Leica Confocal Software
Air table	Newport	VH 3036W-OPT
Laser	Spectra-Physics		Tsunami Mode-locked Ti:sapphire laser
CCD camera	pco AG, Kelheim, Germany	PixelFly QE	including control software
Micropipette glass capillaries	Hilgenberg, Malsfeld, Germany	1408411
Micropipette puller	Sutter Instrument	P-97
Alexa Fluor 594	Invitrogen	A-20004	fluorescent dye
Neurobiotin	Axxora	VC-SP-1120-M050	non-fluorescent tracer
Streptavidin-Cy3	Dianova	016-160-084
Micromanipulator	Luigs & Neumann GmbH, Ratingen, Germany	210-100 000 0010	motorized Mini25 manipulator unit with display SM-5
Patch-clamp amplifier	npi electronic GmbH, Tamm, Germany	SEC-05LX npi
Digitizer	National Instruments	BNC-2090
Data acquisition software WinWCP	John Dempster, University of Scotland, Glasgow, UK		http://spider.science.strath. ac.uk/sipbs/ software.htm
Visual stimulus generator QDS	Thomas Euler, University of Tübingen, Germany		has to be operated on a separate computer controlling 2 monitors (user interface, stimulus monitor)
Neutral density filters	ITOS, Mainz, Germany