Electrophysiological विशेषता GFP-व्यक्त बरकरार रेटिना में सेल आबादी

Summary

यह लेख बरकरार माउस रेटिना में fluorescently टैग neuronal आबादी से व्यक्ति की कोशिकाओं की रिकॉर्डिंग दर्शाया गया है. दो photon अवरक्त उत्तेजना का उपयोग करके transgenetically लेबल कोशिकाओं पैच दबाना रिकॉर्डिंग के लिए निशाना बनाया गया उनके प्रकाश प्रतिक्रियाएं, ग्रहणशील फ़ील्ड गुण, और आकृति विज्ञान के अध्ययन.

Abstract

Studying the physiological properties and synaptic connections of specific neurons in the intact tissue is a challenge for those cells that lack conspicuous morphological features or show a low population density. This applies particularly to retinal amacrine cells, an exceptionally multiform class of interneurons that comprise roughly 30 subtypes in mammals¹. Though being a crucial part of the visual processing by shaping the retinal output², most of these subtypes have not been studied up to now in a functional context because encountering these cells with a recording electrode is a rare event.

Recently, a multitude of transgenic mouse lines is available that express fluorescent markers like green fluorescent protein (GFP) under the control of promoters for membrane receptors or enzymes that are specific to only a subset of neurons in a given tissue^3,4. These pre-labeled cells are therefore accessible to directed microelectrode targeting under microscopic control, permitting the systematic study of their physiological properties in situ. However, excitation of fluorescent markers is accompanied by the risk of phototoxicity for the living tissue. In the retina, this approach is additionally hampered by the problem that excitation light causes appropriate stimulation of the photoreceptors, thus inflicting photopigment bleaching and transferring the retinal circuits into a light-adapted condition. These drawbacks are overcome by using infrared excitation delivered by a mode-locked laser in short pulses of the femtosecond range. Two-photon excitation provides energy sufficient for fluorophore excitation and at the same time restricts the excitation to a small tissue volume minimizing the hazards of photodamage⁵. Also, it leaves the retina responsive to visual stimuli since infrared light (>850 nm) is only poorly absorbed by photopigments⁶.

In this article we demonstrate the use of a transgenic mouse retina to attain electrophysiological in situ recordings from GFP-expressing cells that are visually targeted by two-photon excitation. The retina is prepared and maintained in darkness and can be subjected to optical stimuli which are projected through the condenser of the microscope (Figure 1). Patch-clamp recording of light responses can be combined with dye filling to reveal the morphology and to check for gap junction-mediated dye coupling to neighboring cells, so that the target cell can by studied on different experimental levels.

Protocol

निम्नलिखित विवरण मानता है कि experimenter रेटिना संरचना, पैच दबाना रिकॉर्डिंग, और दो photon माइक्रोस्कोपी की एक बुनियादी समझ है. एक सेटअप पैच दबाना और दो photon इमेजिंग प्रणाली स्थापित करने और चलाने पर उपयोगी जानकारी के लिए refs देखें [7-12]. 1. पशु और ऊतक तैयारी माउस एच. कम से कम 3 के लिए अंधेरे अनुकूलित रखें इस बीच में, कोशिकी से मिलकर समाधान के 1-2 एल (मिमी) 125 NaCl KCl 2.5, 1, 2 CaCl, 1.6 MgCl 2, 25 3 NaHCO, 10 D शर्करा तैयार है और carbogen साथ बक द्वारा यह 7.4 पीएच संतुलित करना कमरे के तापमान पर (5% 2 हे में सीओ 2). एक एक हवा तंग कक्ष में सीओ 2 ग्रीवा अव्यवस्था के बाद अधिक मात्रा द्वारा माउस euthanize. यह प्रक्रिया और निम्नलिखित कदम अंधेरे में किया जाना चाहिए. मंद रोशनी लंबे तरंगदैर्ध्य (हम एक ठंड प्रकाश स्रोत से एक 690 एनएम longpas कम तरंगदैर्य ब्लॉक का उपयोग करेंफिल्टर) व्यक्तिगत दृष्टिकोण का समर्थन करने के लिए, जबकि जानवर की आँखें काले अनुकूलित (चूहों प्रकाश स्पेक्ट्रम के लाल भाग में केवल गरीब दृष्टि है) रखने के. पूरी तरह अंधेरे का उपयोग अवरक्त रोशनी (> 800 एनएम) में काम करने के लिए और रात दृष्टि काले चश्मे पहनते हैं. घुमावदार परितारिका कैंची की एक जोड़ी और उन्हें कोशिकी एक विदारक खुर्दबीन के नीचे रखा समाधान की एक डिश के लिए स्थानांतरण के साथ स्पष्टीकरण करना आँखें. कॉर्निया और वसंत कैंची की एक जोड़ी (हम पहले पियर्स के लिए एक नुकीला काटने के लिए एक प्रारंभिक बिंदु का उपयोग करें) के साथ ora serrata (रेटिना और सिलिअरी शरीर के बीच की सीमा) के साथ आंख बल्ब खोलने से सिलिअरी शरीर निकालें. लेंस बाहर ले लो और ध्यान से रेटिना वर्णक उपकला अलग. यदि रेटिना के उन्मुखीकरण अपने अध्ययन के लिए महत्वपूर्ण है, रेफरी में संकेत मिलता है यह पसंद है. [12] और रेटिना वर्णक और उपकला के बीच ऑप्टिकल तंत्रिका कट और eyecup से रेटिना हटायें. रेटिना सतहों की दिशा नोट: कर्ल करवाने के रेटिना के अंदर gangl हैआयन सेल की ओर, बाहर फोटोरिसेप्टर की ओर है. भीतर रेटिना की सतह से धीरे यह एक लकड़ी दंर्तखोदनी की सहायता के साथ बंद खींच कर शीशे निकालें. इस प्रयोजन के लिए, कोशिकी समाधान है कि सिर्फ रेटिना को शामिल किया गया है की एक छोटी मात्रा का उपयोग करें. दंर्तखोदनी शीशे चिपक जाती है और रेटिना बंद केन्द्रापसारतया घसीटा जा सकता है. फिर, रेटिना ऊतक के सपाट की सुविधा की परिधि साथ छोटे चीरों लागू. रिकॉर्डिंग कक्ष नीचे फोटोरिसेप्टर पक्ष में रेटिना स्थानांतरण, कांच के तल पर इसे बाहर फैल (हम एक ठीक ब्रश का उपयोग करें) और यह नायलॉन अनुभूत स्टेनलेस स्टील के एक फ्रेम के साथ स्थिर है. उसी तरह में दूसरा रेटिना तैयार रखने और इसे बाद में उपयोग के लिए carboxygenated कोशिकी समाधान में अंधेरा अनुकूलित. 2. रिकॉर्डिंग रिकॉर्डिंग कक्ष अंधेरे में एक ईमानदार लेजर स्कैनिंग खुर्दबीन के नीचे स्थापित और रेटिना तैयारी लगातार superfuse (मिलीग्राम / नहीं कम से कम 5 मीलn) carboxygenated कोशिकी समाधान के साथ 35 डिग्री सेल्सियस पर गरम माइक्रोस्कोप (यह भी एक अवरक्त के प्रति संवेदनशील सीसीडी कैमरे के साथ सुसज्जित) एक सदमे को अवशोषित इलेक्ट्रॉनिक परिरक्षण के लिए एक फैराडे पिंजरे के अंदर हवा की मेज पर स्थित है. एक गैर पारदर्शी पर्दा के साथ पिंजरे को कवर करने के लिए अंधेरे में तैयारी रखने के लिए. हम भी लाल पारदर्शी फिल्म के द्वारा कंप्यूटर मॉनिटर से प्रकाश स्क्रीन बंद. 850-870 एनएम या अब तरंगदैर्य अवरक्त लेसर ट्यून, मोड बंद हालत के लिए स्विच करने के लिए, और दो photon उत्तेजना का उपयोग करने के लिए GFP-व्यक्त कोशिकाओं कल्पना. लेजर लेजर स्कैनिंग सॉफ़्टवेयर के द्वारा नियंत्रित है कि सिर्फ फ्लोरोसेंट सेल की स्पष्ट मान्यता के लिए पर्याप्त है एक डिग्री करने के लिए नीचे तटस्थ घनत्व फिल्टर का उपयोग उत्पादन attenuate वर्तमान दबाना मोड का उपयोग कांच micropipettes में पैच दबाना रिकॉर्डिंग (हम 1.5 मिमी की बाहरी व्यास और 0.225 मिमी की दीवार मोटाई के borosilicate ग्लास टयूबिंग उपयोग) intracellular से मिलकर समाधान (मिमी) 125 कश्मीर gluconate, 10 KCl, 0.5 EGT से भराए, 10 HEPES KOH (बारे MΩ 5 की एक विंदुक प्रतिरोध देने) के साथ 7.4 पीएच titrated. नोट है कि वोल्टेज दबाना रिकॉर्डिंग जैसे अन्य प्रयोगात्मक शर्तों एक अलग समाधान की आवश्यकता होती है. यदि डाई इंजेक्शन वांछित हैं, एक फ्लोरोसेंट (हम 10 मिमी Alexa Fluor 594 का उपयोग करें) जांच या एक ट्रेसर अणु (3% Neurobiotin) जोड़ें. धारक में micropipette सम्मिलित करें और सुनिश्चित करें कि संदर्भ इलेक्ट्रोड (chlorinated चांदी के तार) रिकॉर्डिंग कक्ष में कोशिकी समाधान के साथ संपर्क में है. Micropipette के लिए दबाव लागू करें और लक्ष्य एक GFP-व्यक्त सेल (हम 40 गुना एक पानी विसर्जन उद्देश्य का उपयोग करें, 1.25 एनए). लंबे प्रबर्धों से रहित कोशिका निकायों नाड़ीग्रन्थि सेल (सीधे रेटिना की वर्तमान अभिविन्यास में सतह के नीचे) के भीतर परमाणु परत के समीपस्थ हिस्सा (55-75 तैयारी भीतर गहरे बारे सुक्ष्ममापी) में परत के रूप में के रूप में अच्छी तरह से में स्थित हैं. Micropipette लक्षित सेल, भीतर सीमित झिल्ली (glial endfeet से बना म्यान) के साथ रेटिना पर संपर्क करने से पहलेसतह के लिए penetrated हो गया है. सफल पैठ intracellular समाधान है कि micropipette सिरे से प्रेरित है और अंतर्निहित रेटिना ऊतक से भीतर सीमित झिल्ली के रूप में एक अवरक्त संचरण आईआर – सीसीडी कैमरे द्वारा कब्जा कर लिया छवि पर देखा जा सकता है detaches द्वारा मान्यता प्राप्त है. IR-सीसीडी कैमरा रिकॉर्डिंग micropipette की स्थिति दिखाने के चित्र के साथ दो photon छवि से सोम स्थिति की तुलना द्वारा वांछित सेल दृष्टिकोण. ध्यान दें कि इस कदम को आसानी से हासिल नहीं किया है और कुछ अभ्यास की आवश्यकता है, क्योंकि सेल GFP-व्यक्त अवरक्त संचरण छवि में मान्यता प्राप्त होना क्रम में यह दिशा में micropipette प्रत्यक्ष है. सही लक्ष्यीकरण हासिल की है, जब micropipette टिप कि दो photon छवि में देखा जा सकता है है कोशिका की सतह के प्रगर्तन का कारण बनता है है. इस प्रक्रिया के लिए वैकल्पिक, intracellular समाधान में एक फ्लोरोसेंट रंजक (जैसे Alexa Fluor 594, 100 सुक्ष्ममापी) का उपयोग करने के लिए दो photon छवि में micropipette स्थिति प्रकट. दो photon अवरक्त उत्तेजना इस डाई की पर्याप्त प्रतिदीप्ति micropipette प्रत्यक्ष बनाने के लिए अनुमति देता है. इस प्रयोजन के लिए, लेजर स्कैनिंग के लिए भी लाल प्रतिदीप्ति कवर सॉफ्टवेयर में पता लगाने रेंज को समायोजित. Micropipette से दबाव रिलीज और वर्तमान क्लैंप मोड में एक पूरे सेल पैच दबाना विन्यास प्राप्त. एक प्रयोग करने योग्य रिकॉर्डिंग -50 के लिए -55 एम वी के एक झिल्ली क्षमता और कम से कम 20 मिनट के लिए पिछले देना चाहिए. वर्तमान दृश्य एक उत्तेजना है (हम थॉमस यूलर, विश्वविद्यालय के Tübingen, जर्मनी द्वारा QDs उपयोग) एक कंप्यूटर मॉनीटर पर सॉफ्टवेयर 11 के द्वारा बनाई गई उत्तेजनाओं . दर्ज सेल पर केंद्रित किया जा उत्तेजना के स्थानिक स्थान समायोजित: मार्क आईआर – सीसीडी कैमरा और केंद्र पर यह एक मौके की तरह उत्तेजना के संचरण छवि दिखाने के मॉनीटर पर सेल की स्थिति. किरण पथ में तटस्थ घनत्व फिल्टर डालने से उत्तेजना तीव्रता ट्यून. मॉनिटर स्पेक्ट्रम और तीव्रता के अंशांकन के लिए [14] Ref देखें. Prolonge चुनेंघ interstimulus अंतराल (जैसे 15 एस) अनुकूलन से बचने के लिए. किरण पथ के भीतर एक photodiode उत्तेजना समय के रिकार्ड रखना शामिल करें. उत्तेजना प्रोटोकॉल आरंभ और प्रकाश प्रतिक्रियाओं (हम गैर spiking कोशिकाओं के लिए 5 kHz पर फ़िल्टरिंग के साथ 10 kHz के एक नमूना दर का उपयोग करें, स्पाइक रिकॉर्डिंग के लिए 20 kHz की तरह एक उच्च नमूना दर की सिफारिश की है) रिकॉर्ड. रिकॉर्डिंग सॉफ्टवेयर को ट्रिगर प्रकाश उत्तेजना सॉफ्टवेयर का प्रयोग करें. डाई के लिए भरने के 30-45 मिनट के लिए दर्ज सेल में सावधानी retracting पहले फ्लोरोसेंट एजेंट फैलाना सेल से micropipette चलो. ख्याल रखना बाहर खींच नहीं सेल शरीर है. यदि गैर फ्लोरोसेंट ट्रेसर Neurobiotin इस्तेमाल किया गया था, यह बंधन से दृश्य की जरूरत है एक fluorophore संयुग्मित streptavidin (हम रात खत्म 4 Cy3-streptavidin, 1:400 का उपयोग ° सी रेटिना के 20 मिनट paraformaldehyde निर्धारण के बाद, डाई युग्मन के लिए पढ़ाई streptavidin ऊष्मायन 3 घ के लिए लंबे समय तक किया जा सकता है). वैकल्पिक रूप से, इंजेक्शन के साथ भी प्रदर्शन किया जा सकता हैतेज (> MΩ 100) इलेक्ट्रोड जब डाई iontophoretically सेल impaled (आयताकार दालों: 0.25-1 एनए, 100 एमएस, अंतराल 100 MS, कुल समय 3-6 मिनट) में संचालित है. 3. प्रतिनिधि परिणाम: निम्न परिणाम प्रमोटर के तहत 13,14 tyrosine hydroxylase, catecholamine संश्लेषण में कदम (:: GFP माउस वें) सीमित दर उत्प्रेरित एंजाइम के लिए हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) व्यक्त एक माउस पर एक अध्ययन से उत्पन्न. GFP संकेत के दो अलग सेल आबादी की चमक के आधार पर अलग पहचाना (चित्रा 2A) हैं. उच्च GFP स्तर व्यक्त कोशिकाओं सेल भीतर परमाणु परत (लीग, चित्रा 2A) में स्थित या नाड़ीग्रन्थि सेल परत में विस्थापित (GCL, चित्रा 2B) निकायों के अधिकारी और भीतर जालक – रूप परत के बीच में विभक्त हो जाना (आईपीएल, चित्रा 2C) . वे टाइप 2 14-16 कोशिकाओं के रूप में पहचान की गई और व्यवस्थित आकारिकी सम्मान के साथ अध्ययन किया जा सकता है (चित्रा 3 ) और चुनावrical गतिविधि (चित्रा 4) भले ही इसकी जनसंख्या घनत्व केवल 250 कोशिकाओं / 2 मिमी के बराबर है. चित्रा 1. प्रयोगात्मक सेटअप के योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व. दो photon उत्तेजना (लाल बिंदीदार प्रकाश पथ) fluorophore बरकरार रेटिना में कोशिकाओं व्यक्त सक्षम बनाता है दृश्य एक micropipette (हरी उत्सर्जन प्रकाश पथ) द्वारा लक्ष्यीकरण. रेटिना ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप (पीले प्रकाश पथ) के कंडेनसर के माध्यम से अनुमान stimuli करने के लिए अधीन है, और सेलुलर प्रकाश प्रतिक्रियाओं को दर्ज कर रहे हैं. चित्रा 2. GFP-व्यक्त एक वें की एक रेटिना flatmount में कोशिकाओं: GFP माउस. टाइप 1 (डीए कोशिकाओं) कोशिकाओं को कमजोर प्रतिदीप्ति (ए, arrowheads को देख) दिखा लीग में स्थित और तीव्रता लेबल टाइप 2 कोशिकाओं: दो आबादी GFP संकेत की चमक द्वारा प्रतिष्ठित किया जा सकता हैया तो लीग (एक, तीर देखें) में या GCL (बी) और आईपीएल की परत S3 (सी) में एक वृक्ष के समान स्तरीकरण में विस्थापित सेल निकायों के साथ. स्केल सलाखों, 50 सुक्ष्ममापी. चित्रा 3 टाइप 2 ट्रेसर Neurobiotin इंजेक्शन के साथ सेल की आकृति विज्ञान. ट्रेसर बाद streptavidin Cy3 बंधन (मैजंटा) द्वारा visualized किया गया था. माइक्रोग्राफ, जो भी GFP संकेत (हरा) का चित्रण है GCL और आईपीएल कवर छवि के ढेर के एक प्रक्षेपण है. स्केल बार, 50 सुक्ष्ममापी. चित्रा 4. टाइप 2 GCL में स्थित सेल की लाइट के हिमायती हैं. रिस्पांस सफेद Scotopic रेंज में बढ़ती तीव्रता के प्रकाश रोशनी के पूरे क्षेत्र के लिए पैटर्न. उत्तेजना तीव्रता रॉड (आरएच * / / छड़ी) प्रति सेकंड प्रति photoisomerizations में दिया जाता है. 3 एस के एक लंबे समय तक उत्तेजना के लिए बेहतर अलग इस्तेमाल किया गया थाउत्तेजना शुरुआत में प्रतिक्रिया घटकों (प्रतिक्रिया पर) और ऑफसेट (प्रतिक्रिया रवाना) के आयन.

Discussion

इस विधि दृश्य मार्गदर्शन के अंतर्गत बरकरार रेटिना में विशिष्ट न्यूरॉन्स की रेटिना की adaptational हालत को प्रभावित किए बिना बिजली के गुणों का अध्ययन करने की संभावना प्रदान करता है. यह विशेष रूप से कोशिकाओं है कि वर्तमान में कर रहे हैं बल्कि खराब लंबे प्रबर्धों से रहित कोशिकाओं के अधिकांश आबादी की तरह कम जनसंख्या घनत्व के कारण अध्ययन के लक्षण वर्णन के लिए अनुकूल है. दो photon उत्तेजना ^में 17 ऊतक के गहरे भागों, सटीक लक्ष्यीकरण के लिए एक शर्त और सफल पैच clamping सेल निकायों के उच्च घनत्व के साथ लीग में विशेष रूप से कोशिकाओं की. से भी उच्च संकल्प और उच्च विपरीत इमेजिंग परमिट

पृथक माउस रेटिना प्रयोगात्मक शर्तों के तहत 3-4 घंटे के लिए व्यवहार्य है. अगर दूसरा रेटिना निरंतर carbogen बक के तहत पूरी तरह अंधेरे में संग्रहीत किया जाता है, यह कड़ा photopigment के बैंगनी रंग बरकरार रखती है और पहली रेटिना के प्रयोगों के साथ खत्म करने के बाद इस्तेमाल किया जा सकता है. शुरुआत में, लक्ष्यीकरणरेटिना wholemount में micropipette के साथ चयनित कक्ष एक चुनौतीपूर्ण सा है और कुछ अभ्यास की आवश्यकता है है, खासकर जब अंधेरे में काम. Micropipette में एक फ्लोरोसेंट रंजक शामिल प्रक्रिया को सरल बनाने, क्योंकि सेल और micropipette एक ही समय में दो photon उत्तेजना के तहत दिखाई दे रहे हैं कर सकते हैं. हालांकि, intracellular समाधान के लिए घटकों को जोड़ने gigaseal गठन में बाधा या रिकॉर्डिंग गुणवत्ता पीड़ित करने के लिए कारण हो सकता है. एक बार सफलतापूर्वक हासिल की है, एक अच्छा रिकॉर्डिंग के बारे में 1 एच. के लिए पिछले कर सकते हैं

अवरक्त उत्तेजना प्रकाश जबकि खुद ही खराब रेटिना photoreceptors के द्वारा अवशोषित है, उत्साहित GFP-व्यक्त कोशिकाओं स्पेक्ट्रम के दृश्य भाग में प्रकाश फेंकना. हालांकि, fluorophores कि रेटिना की adaptational हालत बदलने की संभावना नहीं है एक छोटे फोकल मात्रा में ही उत्साहित कर रहे हैं. सभी अधिक उत्तेजना, केवल लक्षित करने के लिए की जरूरत है और प्रकाश प्रतिक्रियाओं का रिकॉर्डिंग के दौरान बंद किया जा सकता है.

usefulnइस दृष्टिकोण का ईएसएस पहले से ही लंबे प्रबर्धों से रहित ^14,18 कोशिकाओं जिसमें से electrophysiological रिकॉर्डिंग अन्यथा केवल ¹² दुर्घटना के द्वारा संभव हो गया होगा की विशिष्ट आबादी पर अध्ययन के द्वारा प्रदर्शन किया है . अंत में, इस शक्तिशाली तकनीक के आगे एक औषधीय ^{दृष्टिकोण 14,} 2 ^{Ca +} 19 इमेजिंग सहित द्वारा या immunocytochemical अध्ययन या इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के लिए इंजेक्शन कोशिकाओं का उपयोग करके बढ़ाया जा सकता है. इस तरह, रेटिना circuitry में एक दिया सेल प्रकार के कार्यात्मक स्थिति को सुलझाया जा सकता है.

Materials

Reagent/Equip-ment	Company	Catalogue number	Comments
Night-vision goggles	Gutzeit GmbH, Warthausen, Germany	Xtron F1	includes a 800 nm light source
Optical filter	Schott, Mainz, Germany	RG9	longpass filter with cutoff at 690 nm
Iris scissors	Fine Science Tools	14061-09	curved with 22 mm blade
Spring scissors	Fine Science Tools	15000-00	straight with 3 mm blade
Recording chamber	Luigs & Neumann GmbH, Ratingen, Germany	200-100 500 0180 type A(TC)	Teflon chamber with bottom-mounted glass cover slip (approx. 0.15 mm; No. 200-100 500 0182)
Flow heater	Multichannel Systems, Reutlingen, Germany	PH01, TC01	heatable perfusion cannula with temperature sensor and temperature controller
Laser scanning microscope	Leica Microsystems	DM LFS	controlled by Leica Confocal Software
Air table	Newport	VH 3036W-OPT
Laser	Spectra-Physics		Tsunami Mode-locked Ti:sapphire laser
CCD camera	pco AG, Kelheim, Germany	PixelFly QE	including control software
Micropipette glass capillaries	Hilgenberg, Malsfeld, Germany	1408411
Micropipette puller	Sutter Instrument	P-97
Alexa Fluor 594	Invitrogen	A-20004	fluorescent dye
Neurobiotin	Axxora	VC-SP-1120-M050	non-fluorescent tracer
Streptavidin-Cy3	Dianova	016-160-084
Micromanipulator	Luigs & Neumann GmbH, Ratingen, Germany	210-100 000 0010	motorized Mini25 manipulator unit with display SM-5
Patch-clamp amplifier	npi electronic GmbH, Tamm, Germany	SEC-05LX npi
Digitizer	National Instruments	BNC-2090
Data acquisition software WinWCP	John Dempster, University of Scotland, Glasgow, UK		http://spider.science.strath. ac.uk/sipbs/ software.htm
Visual stimulus generator QDS	Thomas Euler, University of Tübingen, Germany		has to be operated on a separate computer controlling 2 monitors (user interface, stimulus monitor)
Neutral density filters	ITOS, Mainz, Germany