Härledning av stödjeceller begränsade prekursorer från E13 möss

Summary

Detta protokoll beskriver härledningen av stödjeceller begränsade prekursorer från foster ryggmärg och underhålls in vitro antingen för transplantation eller för att studera oligodendrocytic härstamning.

Abstract

Detta är ett protokoll för härledning av gliaceller begränsade föregångare (BRP) celler från ryggmärgen hos E13 mus foster. Dessa celler är tidiga föregångare inom oligodendrocytic cellsläktträd. Nyligen har dessa celler studerats som potentiell källa för återställande behandlingar i vita materia sjukdomar. Periventrikulär leukomalasi (PVL) är den vanligaste orsaken till icke-genetiska vit substans sjukdomar i barndomen och drabbar upp till 50% av extremt för tidigt födda barn. Uppgifterna tyder på en ökad känslighet att utveckla hjärnan att hypoxi-ischemi, oxidativ stress och excitotoxicitet som selektivt riktar begynnande vita substansen. Gliala begränsade prekursorer (GRP), oligodendrocytceller progenitorceller (OPC) och omogna oligodendrocyter (preOL) verkar vara viktiga aktörer i utvecklingen av PVL och är föremål för fortsatta studier. Vidare har tidigare studier identifierat en delmängd av CNS-vävnad som har ökad mottaglighet för glutamatexcitotoxicitet somsamt en utvecklingsmönster till denna känslighet. Vårt laboratorium undersöker för närvarande roll oligodendrocytceller föregångare i PVL och användning celler på GRP utvecklingsstadium. Vi använder dessa härrör GRP celler i flera experimentella paradigm för att testa deras svar att välja spänningar överensstämmer med PVL. GRP-celler kan manipuleras in vitro till OPCs och preOL för transplantation experiment med möss PVL och i in vitro modeller av PVL-liknande förolämpningar inklusive hypoxi-ischemi. Genom att använda odlade celler och in vitro studier där skulle minska variabilitet mellan experiment som underlättar tolkningen av data. Odlade celler möjliggör också för anrikning av GRP befolkningen och samtidigt minimera påverkan av förorenande celler av icke-GRP fenotyp.

Protocol

Införandet I detta protokoll visar vi hur du extraherar, välja och plattan gliaceller begränsade föregångare (BRP) celler från ryggmärg från E13 mus foster. Dessa celler är tidiga föregångare inom oligodendrocytic och astrocytisk cellinjer och definieras genom deras expression av A2B5. I GRP-medium kompletterat med FGF-2, kommer A2B5 + GRP börjar uttrycka den tidiga oligodendrocytic linjemarkörer PDGFαR och NG2 1,2. Dessa oligodendrocythärkomst celler passerar genom en serie av olika fenotypiska steg, var en av dem som kännetecknas av morfologiska förändringar, samt uttryck av markörer för specifika utvecklingsstadier. Dessa prekursorceller för närvarande studeras som en potentiell källa för cell-baserade terapeutiska strategier i sjukdomar i det centrala nervsystemet vit substans, inklusive multipel skleros, leukodystrophies och periventrikulär leukomalasi (PVL) 3,4,5,6 </sup>. Studier med mänskliga hjärnan härstammar oligodendrocythärkomst föregångare har rapporterat framgångsrika remyelinisering i hjärnor hos shiverer musen dysmyelination modell samt i demyelinerade ryggmärgen gnagarmodeller 6,7,8,9. Dessa gliaceller prekursorceller har också använts i studier av andra vita modeller ämnen sjukdom såsom ryggmärgsskada och amyotrofisk lateral skleros 10,11,12,13. Vårt laboratorium har utvecklat en tidig postnatal hypoxi-ischemi musmodell som vi utvärderar effekten av dessa ryggmärgen härledas GRP celler som en reparativ strategi i PVL, den ledande orsaken till cerebral pares 14,15,16. Det finns också en gnagare hjärna härledd OPC modell som har använts i stor omfattning för att studera vit substans skada, eftersom de GRP-celler har en tendens att differentiera in i astrocytisk reaktionsvägen 17. OPC fenotypen har redan kommit in i oligodendrocythärkomst väg, ett fenomen som verkar irreversible. Men vi är intresserade av att mäta effekten av en bredare spektrum av oligodendrocytceller progenitorer inklusive GRP och möjligen även noppor som härrör till E10.5. Av denna anledning har vi antagit ryggmärgen härrör GRP modell för vårt arbete. Förutom användningen av GRP för cell utbyte medger härledningen av dessa celler från vildtyp och transgena modeller gnagare av vit substans sjukdomar vidare studier i gliaceller differentiering under normala och sjukdom villkor i en in vitro miljö. Tidigare publikationer visar tecken på selektiv sårbarhet oligodendrocytic cellinjen föregångare till olika externa faktorer såsom mognad beroende glutamatexcitotoxicitet, oxidativ stress, och välj faktorer som är inblandade i neuroinflammation 18,19. Våra studier har fokuserat på att förstå de cellulära och molekylära mekanismer bakom utvecklingen av dessa vita materia skador, utvärdera känsligheten hos celler iden oligodendrocythärkomst spektrumet att förolämpa samt analysera förmodade terapeutiska metoder. Material Alla som deltar i djurförsök överensstämmer med PHS politik och JHU lACUC. Alla procedurer bör utföras i en huv med laminärt flöde för att bibehålla aseptiska förhållanden. Vanligen dissektioner utförs i en horisontell dragskåp och in vitro arbete i en vertikal dragskåp. Alla medier som används kallt under dissektioner. De möss som användes i vår studie är en vild typ CD-1-stam och en transgen GFP i ett C57/BL6 bakgrund. En CD-1 mus dammen ger vanligtvis 10 + foster som är tillräckligt för att utsäde 1-2 T25 kolvar. Typiskt är två dammar avlivades vid en tidpunkt och fetala ryggmärg poolades och utströks i en T25-kolv per dammen. När väl cellerna har härlett de kan expanderas och karaktäriserades in vitro för efterföljande studier. 1. Beredning av media och kolvar GRP lagerMediet som användes som Dissektion mediet: DMEM / F12 1:1 (Invitrogen) + B27 (50x; Invitrogen) n2 (100x; Invitrogen) tillskott och bovint serumalbumin (BSA; 0,5% vikt / volym). Dissociation medium: samma som dissekering medium. Odlingsmedium: GRP lager medium + FGF-2 (10-20 ng / ml; Invitrogen) och heparin (1 | ig / ml, Sigma). PLL / lamininbelagda 75 cm 2 eller 25 cm 2 kolvar (T75 eller T25). Vävnadsodlingsflaskor (75 cm 2, Falcon) belades med 15-20μg/ml Poly-L-lysin (PLL, Sigma) i destillerat H2O, inkuberades vid 37 ° C under 1 h aspirerades sedan. Kolvarna tvättades 1 X med PBS belades därefter med 15-20 | ig / ml laminin (Sigma) i PBS vid 37 ° C under 1 timme, därefter aspireras och färsk PBS eller medium tillsattes tills cellerna färdiga som skall pläteras. Efter beläggningen bör kolvar aldrig tillåtas att torka men kan hållas i PBS eller medium vid 4 ° C under korta perioder innan användning. 2. Instrument och andra Material Petriskålar: 4 per Dam: 3 petriskålar för dissektion (75 mm), en 20 mm skål för att samla in de skördade ryggmärgen. Stora sax (43 mm Operativsystem sax, Roboz) och Tång vävnad för att öppna dammen s buken. Liten sax för dissekera livmodern och ta bort foster (15 mm Micro dissekera sax, Roboz). Micro dissekera våren sax (6 mm) för att dissekera ryggmärgen av fostren. Micro Analysera vinklade Tång för att förankra dammen och fostrets kropp under operation och senare ta bort ryggmärgen gång utsätts för. 40 eller 70 mikrometer cellfilter för avlägsnande av celldebris före plätering. 0,05% trypsin förvärmt till 37 ° C. 10 mg / ml DNAs 1 (Sigma), framställd som en 100x stamlösning (1 g / ml). Bio-fara väska för djurkroppar. 15 och 50 ml centrifugrör för bearbetning extraherades ryggmärg. 3. Bestämning tidsinställd Pregnancy Gravida mus dammar antingen beställas från kommersiella källor anger leverans på embryonala dag E12 eller E13 av fostrets utveckling eller graviditeten bestäms i egen regi. I korthet är två honor placeras tillsammans med en hane i den sena eftermiddagen och fick stå över natten tillsammans. Nästa dag honor observerades för närvaron av vaginalt ligger slemproppen. Den plugg slem är endast en indikation på att parning inträffade så djuren därefter vägdes dagligen för att kontrollera hastigheten för viktökning. Den dag då slemproppen observeras definieras som embryonala dagen (E1). 4. Vävnad Härledning Arbetet under en horisontell dragskåp för att upprätthålla aseptiska förhållanden. Spraya ner huven och arbetsområdet med 70% etanol. Autoklav instrument eller Spraya rikligt med 70% etanol. Förbered instrument, media och mikroskop för användning. Häll 20 ml kallt dissekering medium i sterila Petri dish. Bedöva djur med kloralhydrat (500 mg / kg) administrerades intraperitonealt (IP), följt av cervikal dislokation eller dekapitering. Spraya i buken området damm med 70-90% etanol (desinfektion) Öppna buken med stor sax och pincett. I CD1 och C57/BL6 stammar: Oftast 8 till 14 foster kommer vara inne i livmodern. Antalet foster är stam beroende. Utdrag musen livmodern inklusive valpar och en plats i färskt kallt dissektion medium i en ren petriskål att tvätta blod och vävnader skräp från fostret. Utdrag varje foster ur livmodern hornet och separera dem från den embryonala SAC och moderkakan med hjälp av en liten sax. Överför de extraherade fostren i färskt dissektion medium i ett nytt petriskål. Dissektion medium bör vara vid låg temperatur för att sänka metabolisk aktivitet och bevara livskraften hos härrör celler. Arbetet från och med nu med två tång ochmikro dissekera våren-sax. Arbetar under dissektionsmikroskop, skära huden längs ryggmärgen med mikro kirurgiska saxar och skal hud tillbaka för att exponera ryggmärgen. Transekt ryggmärgen med mikrokirurgisk saxen vid cirka C1 och i början av svansen. Ta bort ryggmärgen med trubbiga pincett, säkerställa att alla ben och brosk tas bort och överföra till 3: e petriskål med dissekera medium. För att förhindra överväxt av meningeal vävnad i efterföljande cellkulturer försöka ta bort så mycket av meningerna som möjligt från ryggmärgen. På grund av begynnande utskjutande perifera nerver är svårare än att ta bort meningeal vävnad från extraherade storhjärnan. När hjärnhinnorna har tagits bort, flytta ryggmärgen till 20 mm petriskål Städa upp genom att grundligt sprutning området med 70-90% etanol. Följande steg för dissociering bör göras snabbt för att upprätthållaen hög lönsamhet för härledda ryggmärgsvävnad. 5. Kultur Etablering Trypsin bör förvärmas till minst 30 min i en 37 ° CH 2 O-bad. En lämplig alikvot bör tas bort från beståndet att minska exponeringen i lager för temperaturförändringar. Överföra de skördade ryggmärg till en 50 ml centrifugrör innehållande 10 ml förvärmd trypsin (0,05%; Kvalitet Biologicals) och 100 pl DNAs (10 mg / ml) och finfördela kortfattat. Inkubera i 37 ° CH 2 O-bad i 10 minuter. Triturera och inkubera under ytterligare 10 minuter. Tillsätt 5 ml GRP-medium (definierad ovan) och centrifugera under 5 min vid 1000 varv per minut. Aspirera supernatanten och återsuspendera pelleten med 10 ml GRP mediet och tillsätt DNAs-1 (10 mg / ml, Sigma). Inkubera i 37 ° CH 2 O-bad i 10 minuter. Centrifugera 5 min vid 1000 RPM och aspirera supernatanten. Återsuspendera pelleten med freksh GRP medelstora filtrera därefter skräp med en 40 till 70 um cellfilter. Plattan på PLL / laminin belagda 25 cm2 kolvar (T25) och inkubera vid 37 ° C, 95% fuktighet och 5% CO2. 100 procent media ändras på följande dag. Vid denna tidpunkt har GRP fast och började utvidga processer. 6. Immunopanning GRP Befolkning Plate ryggmärgen vävnad i PLL / lamininbelagda flaskor tills kolven är 85-90% sammanflytande eller om en vecka. Skörd celler genom skrapning kolv med en gummiskrapa eller med 0,05% trypsin, triturera noggrant men försiktigt, centrifugerades vid 1000 RPM under 5 min och noggrant återsuspendera pelleten med 3 ml GRP-medium. Överför 1 ml till vardera 3 T25-kolvar eller 3 ml till 1 T75-flaska tillsätt lämpliga volymer medium för att fullständigt täcka cellerna och göra det möjligt kolvar för att nå 80-90% konfluens. Ändra media varannan dag, tidigare om medel tömmer snabbt. Kappa Bakteriologisk Petri skålar (75 mm) över natten vid 4 ° C med en anti-mus IgM-antikropp (Southern Biotech), 10 | ig / ml i PBS. Aspirera överflödig buffert och tvätta petriskålar 3x med PBS. Tillsätt A2B5-antikroppen (Millipore) vid en koncentration av 5 pg / ml utspädd i PBS och inkubera under 1 h vid rumstemperatur (RT). Tvätta plattorna igen 3x med PBS och tillsätt sedan 8 ml GRP medium till att förhindra uttorkning av plattan. Överför 5 ml GRP medium från petriskålar och skörda celler GRP genom att skrapa flaskor med en gummiskrapa att lossna alla celler Finfördela cellsuspension kort för att bryta upp klumpar och överföra 5 ml cellsuspension till A2B5 belagda bakteriologiska petriskålar. Inkubera 1 h vid rumstemperatur utan skakning. Efter 1 timme aspirat media och plattor tvätt 8x med PBS. Försiktigt skrapa celler med en gummiskrapa i 2 ml GRP media sedan överföra till PLL / laminin belagda plattor eller flaskor med lämplig volym av GRP medium. </li> 7. Frysning och lagring av härledda celler Celler skördas från en 85-90% sammanflytande T25 eller T75-kolv med 2 ml 0,05% trypsin. Trypsin späds och inaktiveras med 8 ml GRP lager medium och centrifugerades vid 1000 RPM under 5 minuter. Pellets från T25-kolvar återsuspenderas i 1 ml GRP frysmedium, (GRP lager medium kompletterat med 10% (volym / volym) DMSO och eventuellt 20% FBS). De större pellets från T75 flaskor späds två gånger. Cellsuspensioner av 1,5 – 3 x 10 10,11,12,13 cellerna överförs till kryogena flaskor (Nalgene) och lagrades över natten i en kryogen behållare (Nalgene) innehållande isopropanol vid -80 ° C till långsamt frysa över natten. Efter natten frysa celler överförs till frysboxar och lagras 6 månader till 1 år vid -80 ° C eller längre sikt i N (l). Upptinade cellerna är typiskt 60-80% livsdugliga hög grad beroende på kvaliteten hos PLL / laminin beläggning. </ol> 8. Representativa resultat CO 2 används inte för söva djuret på grund av den eventuella nedströms effekter på lönsamheten av fostren och slutligen de härledda celler. Vidare kommer det att vara mycket svårt att fullständigt avlägsna meningerna från ryggmärgen under härledningen förfarande men kombinationen av GRP-medium och immunopanning kommer att eliminera dessa snabbväxande celler. På liknande sätt är hela ryggmärgen skördades trots en större ventrala koncentration av GRP populationen beroende på dess ursprung i den ventrala ryggmärgen och migrerar dorsalt 20. Men GRP mediet väljer för GRP fenotyp och att befolkningen maximeras genom A2B5 immunopanning. Efter plätering ryggmärgen vävnader är in vitro-kulturerna inkuberades i två passager eller om en vecka. Efter 2 dagar i odling, kan celler från olika morfologier observeras i vävnadsodlingskolvar indikerar heterogeneity av befolkningen men den armerade mediet väljs för GRP-fenotypen. Dessa celler är en kombination av A2B5 + GRP, E-NCAM + neuronala bundna prekursorer (NRP) och nestin +, A2B5-neuroepitelceller och eventuellt fibronektin + meningeala celler. Dessutom kan mer mogna fenotyper vara närvarande uttrycker markörer inklusive doublecortin och Tuj1 för neuronal härstamning, GFAP för astrocyter och PDGFaR och GalC för oligo linjen För att maximera en mycket GRP anrikad population från start heterogena poolen (Figur 1A), celler kan vara dubbelt-immunopanned att välja och eliminera E-NCAM +-celler följt av selektion för A2B5 + GRP befolkningen när celltätheten har ökat till ca 85-90% konfluens i T75 kolvar. Dessa GRP celler bibehåller sin förmåga att bli astrocyter trots att i ett medium som väljer att oligodendrocyt fenotypen så senare A2B5 immunopanning kan vara nödvändigt för att upprätthålla en höganrikat GRP befolkningen. Immunopanning geneallierade utbyten upp till 95% A2B5 + celler men för ännu större utbyte A2B5 konjugerade magnetiska pärlor (Miltenyi Biotec Inc.) kan användas för att tillhandahålla ett utbyte av upp till 97%. Vaksamhet i de kulturer underhåll GRP såsom regelbundna media förändringar kommer att minimera spridningen av icke-GRP celltyper. Även i avsaknad av BMP-4 kan astrocyter fortfarande hittas och utarmat media i synnerhet tycks inducera differentiering till en astrocytisk fenotyp. Fastän B27 supplement innehåller tri-jodtyronin hormon (T3), har det inte funnits någon observerad tendens att differentiera till oligodendrocyter i den armerade populationen, endast när högre nivåer av T3 sättes till mediet inte detta fenomen inträffar. Däremot kan en T3 fritt B27 tillägg bytas om det finns en oro för kontaminering av mogna oligodendrocyter (Figur 1B). Dessa GRP celler kan lätt identifieras genom deras morfologi av små Soma med 2 eller 3 korta processer, utan att screena för andra celltyper, som kan vara närvarande, immunocytochemistry kan utföras för de tidigare nämnda gemensamma utvecklingsmässiga och celltyp specifika markörer. Det kommer vanligen att vara en liten kvarstående population av A2B5-celler som är neuroepitelceller (NEP) och har förmåga att bli antingen GRP eller NRP. Lyckligtvis är de längre celler upprätthölls i GRP-medium, desto mer sannolikt att mediet kommer att välja för GRP-fenotypen. Figur 1. En) stryks ut ryggmärgen celler med heterogen morfologi observerades efter 2 dagar i odling. B) Immunopanning maximerar en höggradigt GRP-anrikad population från utgångsföreningen heterogena poolen.

Discussion

<p class="jove_content"> Sjukdomar i centrala nervsystemet vita substansen innehåller ett stort antal etiologier, inklusive genetiska, inflammatoriska, ischemisk och giftiga orsaker^{19,21,22,23,24}. Medan multipel skleros och vaskulopatier är den ledande orsaken till vit substans sjukdom hos vuxna, är periventrikulär leukomalasi samband med prematuritet den vanligaste orsaken till vita substansen skada i barndomen befolkningen. För att ytterligare avgränsa sjukdomsmekanismer ytterligare studium av celler ofoligodendrocytic härstamning, vilket i hög grad påverkas av den perinatala uttömning, erfordras. GRP isolerades från gnagare embryonala ryggmärgen och visades vara tripotential i naturen, vilket ger upphov till oligodendrocyter och två distinkta populationer astrocytfunktioner, men inte differentiera till neuroner^2,25,26. Likaså har oligodendrocyt prekursorceller (OPC) som härrör från råtta synnerv och sen embryonal eller tidig postnatal råtthjärna visat att mogna till fungerande oligodendrocyter i lämpliga media villkoren^27,28. Dessutom har foster eller vuxna härrör människa OPC har ytterligare manipuleras till mer mogna oligodendrocytceller fenotyper^29,30.</p><p class="jove_content"> GRP celler har isolerats från både ryggmärg från E13.5 råttor och E12-13,5 i möss. I råtta skillnader har rapporterats mellan rygg-och ventral-härlett GRP celler i sina svar på förhållanden som främjar generation av oligodendrocyter, eller astrocyter med ventral-härledda GRP uppvisar en större benägenhet att differentieras till de mer mogna fenotyper^25,26,28. Detta är kan bero på den ventrala till dorsal migration av begynnande GRP cellerna, vilket kan vara mindre mottagliga till differentieringen ledtrådar. Immunopanning medger subpopulationen, och som uttrycker A2B5 kan isoleras och uppsamlas för underhåll i kultur.</p><p class="jove_content"> Våra mus GRP kulturer härrör från total ryggmärgsvävnad som ger en heterogen, poolad population av celler från vilka GRP celler väljs genom kemisk (medium) och antikroppar tekniker. Medan våra studier har utnyttjat ryggmärgen härrör mus GRP celler har det på senare tid rapporterats härledningen i hjärnan som härrör mus oligodendrocyt progenitorceller som också kan utvecklas till mogna oligodendrocyter³¹. Här härledda cellerna initialt odlas som oligospheres att använda ett lämpligt odlingsmedium manipuleras till en berikad PDGFαR +, OPC befolkningen³¹. Våra studier har fokuserat på effekterna av vår modell av hypoxisk-ischemisk insult på celler i oligodendrocythärkomst spektrat från A2B5 +, PDGFαR-GRP prekursorer till myelinbasprotein uttrycker (MBP +) mogna oligodendrocyter. I själva verket vår<em> In vitro</em> Karaktärisering har visat att dessa omogna GRP celler mognar till MBP celler som uttrycker antingen i monokulturer eller co-kulturer med kortikala neuroner. Dessa celler kan manipuleras i odling i specifika differentiering banor för att studera mekanismerna inblandade i perinatal vit substans skada. Det finns flera musmodeller av vit substans sjukdomar som involverar celler av oligodendrocythärkomst och tillgången till denna population tillåter noggrann utredning de mekanismer som orsakar skada samt att undersöka nyttan av möjliga alternativ cellterapi.</p

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number
DMEM/ F12 1:1	Invitrogen	11320033
B27	Invitrogen	17504044
N2	Invitrogen	17502048
rH-FGF-basic	Invitrogen	PHG0026
Trypsin (0.05%) EDTA	Quality Biological, Inc.	118-087-721
POLY-L-LYSINE HBr	Sigma	P1274-25MG
Laminin	Sigma	L2020-1MG
Dnase 1	Sigma	DN25