Tissue Upprättande och immunfärgning av Mouse känselnervtrådar Innervating Hud och Limb Bones
Summary
Immuncytokemiska identifiering av perifer sensorisk subtyper nervtråd (och upptäckt av proteinuttryck däri) är nyckeln till förståelsen av molekylära mekanismerna bakom perifera sensation. Här beskriver vi metoder för beredning av perifer / visceral vävnadsprover, till exempel hud och lem ben, för specifika immunfärgning av perifera sensoriska nervtrådar.
Abstract
Upptäckt och primär behandling av fysiska, kemiska och termiska sensoriska stimuli genom perifer känselnervtrådar är nyckeln till sensorisk perception hos djur och människor. Dessa perifera sensoriska nervtrådar uttrycker en uppsjö av receptorer och jon proteiner kanal som upptäcker och initiera specifika sensoriska stimuli. Det finns metoder att karakterisera de elektriska egenskaperna hos perifera sensoriska nervtrådar innervating huden, som också kan utnyttjas för att identifiera den funktionella uttrycket av specifika proteiner jonkanaler i dessa fibrer. Men liknande elektrofysiologiska metoder finns inte (och är också svårt att utveckla) för detektion av den funktionella uttryck av receptorer och jon proteiner kanal i perifera sensoriska nervtrådar innervating andra inre organ, inklusive de mest utmanande vävnader såsom ben. Dessutom kan sådana elektrofysiologiska metoder inte användas för att bestämma ett uttryck för icke-hetsiga proteinS i perifera sensoriska nervtrådar. Därför ger immunfärgning av perifer / viscerala vävnadsprover för sensorisk nerv fivers på bästa möjliga sätt för att bestämma uttrycket av specifika proteiner av intresse för dessa nervtrådar. Hittills har de flesta av de studier proteinuttryck i sensoriska neuroner utnyttjas immunfärgning förfaranden i sensoriska ganglier, där informationen är begränsad till uttryck av specifika proteiner i cellen organ av specifika typer eller delmängder av sensoriska neuroner. Här rapporterar vi detaljerade metoder / protokoll för beredning av perifer / viscerala vävnadsprover för immunfärgning av perifera sensoriska nervtrådar. Vi specifikt detalj metoder för beredning av huden eller plantar punsch biopsi och ben (lårbenet) sektioner från möss immunfärgning av perifera sensoriska nervtrådar. Dessa metoder är inte bara nyckeln till kvalitativ bestämning av proteinuttryck i perifera sensoriska neuron, utan även ge en kvantitativ metod för att fastställaatt bestämma förändringar i proteinnivåer uttryck i specifika typer eller delmängder av sensoriska fibrer, samt för att bestämma morfologiska och / eller anatomiska förändringar i antalet och densitet av sensoriska fibrer vid olika sjukdomstillstånd. Dessutom är dessa metoder inte är begränsad till färgning av endast sensoriska nervfibrer, men kan även användas för färgning alla typer av nervtrådar i hud, ben och andra viscerala vävnader.
Protocol
Discussion
Här har vi detaljerade metoder för beredning av mus skinn och ben sektioner vävnad för immunfärgning och detektion av perifer sensorisk nervtrådar. Avsnitten produceras från plantar punsch biopsier innehåller både glabrous och håriga huden, vilket innebär att protokollet kan användas på alla hudtyper. Dessa tekniker kan även användas för att färga andra celltyper i dessa vävnader (t.ex. leukocyter, vaskulära endothelia, glatt muskulatur bland andra). Dessa metoder ger en utmärkt kompromiss mellan opt…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Dr Yuriy M. Usachev för hans hjälp under den första standardiseringen av konfokalmikroskopi / avbildning av mus plantar stansbiopsi immunfärgning, och doktor Donna L. Hammond för hennes fortsatta hjälp och konstruktiv kritik i detta arbete. Detta arbete har finansierats av bidrag från NINDS / NIH (NS069898), och en idéutveckling Grant Award från försvarsdepartementet Prostate Cancer Research Program (DoD-PCRP-101.096) till DPM
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue No. | Comment |
| 3mm Harris Micro-Punch | Material | Ted Pella | 15094 | |
| Perfusion pump | Material | VWR International | 23609-170 | |
| Paraformaldehyde | Reagent | Fisher Scientific | T353 | |
| Picric acid | Reagent | Sigma-Aldrich | 239801 | |
| OCT Embedding compound | Reagent | Tissue-Tek | 4583 | |
| Cyto-Freeze cryogenic aerosol spray | Material | Control Company | 3118 | |
| Goat Serum | Reagent | Sigma-Aldrich | G9023 | |
| Incubation tray and lid for Immunostaining (Large) | Material | RPI Corp. | 248270 (tray) 248270-A (lid) |
|
| ImmEdge hydrophobic barrier pen | Material | Vector Laboratories | H-4000 | |
| Camel’s Hair Brushes (#1 thickness) | Material | Ted Pella | 11859 | |
| Pro‐Long Gold Mounting medium | Reagent | Invitrogen | P36930 |
References
- Hoffman, E. M., Schechter, R., Miller, K. E. Fixative Composition Alters Distributions of Immunoreactivity for Glutaminase and Two Markers of Nociceptive Neurons, Nav 1.8 and TRPV1, in the Rat Dorsal Root Ganglion. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 58, 329-344 (2010).
- Neves, J. D. S., Omar, N. F., Narvaes, E. A. O., Gomes, J. R., Novaes, P. D. Influence of different decalcifying agents on EGF and EGFR immunostaining. Acta Histochemica. 113, 484-488 (2011).
- Watson, R. E., Wiegand, S. J., Clough, R. W., Hoffman, G. E. Use of cryoprotectant to maintain long-term peptide immunoreactivity and tissue morphology. Peptides. 7, 155-159 (1986).
- Yen, L. D., Bennett, G. J., Ribeiro-da-Silva, A. Sympathetic sprouting and changes in nociceptive sensory innervation in the glabrous skin of the rat hind paw following partial peripheral nerve injury. The Journal of Comparative Neurology. 495, 679-690 (2006).
- Boyette-Davis, J., Xin, W., Zhang, H., Dougherty, P. M. Intraepidermal nerve fiber loss corresponds to the development of Taxol-induced hyperalgesia and can be prevented by treatment with minocycline. Pain. 152, 308-313 (2011).
- Bloom, A. P. Breast Cancer-Induced Bone Remodeling, Skeletal Pain, and Sprouting of Sensory Nerve Fibers. The Journal of Pain. 12, 698-711 (2011).
- Constantin, C. E. Endogenous Tumor Necrosis Factor α (TNFα) Requires TNF Receptor Type 2 to Generate Heat Hyperalgesia in a Mouse Cancer Model. J. Neurosci. 28, 5072-5081 (2008).
- Jankowski, M. P. Sensitization of Cutaneous Nociceptors after Nerve Transection and Regeneration: Possible Role of Target-Derived Neurotrophic Factor Signaling. The Journal of Neuroscience. 29, 1636-1647 (2009).
- Jimenez-Andrade, J. M. Pathological Sprouting of Adult Nociceptors in Chronic Prostate Cancer-Induced Bone Pain. J. Neurosci. 30, 14649-14656 (2010).
- Persson, A. -. K. Sodium-calcium exchanger and multiple sodium channel isoforms in intra-epidermal nerve terminals. Molecular Pain. 6, 84-84 (2010).
- Ohshima, M., Miyake, M., Takeda, M., Kamijima, M., Sakamoto, T. Staphylococcal Enterotoxin B Causes Proliferation of Sensory C-Fibers and Subsequent Enhancement of Neurogenic Inflammation in Rat Skin. Journal of Infectious Diseases. 203, 862-869 (2011).
- Johnson, M. S., Ryals, J. M., Wright, D. E. Early loss of peptidergic intraepidermal nerve fibers in an STZ-induced mouse model of insensate diabetic neuropathy. Pain. 140, 35-47 (2008).
