सेल चक्र स्थिति के स्तनधारी कोशिकाओं में विश्लेषण
Summary
कक्षों की आबादी की कोशिका चक्र स्थिति निर्धारण, या समझ कैसे संकेतों के प्रसार को प्रभावित, प्रवाह cytometry द्वारा इस प्रोटोकॉल का उपयोग आसानी से मापा जा सकता है है. हम एक साधारण कोशिकाओं को धुंधला हो जाना और कोशिका चक्र में अपनी स्थिति बढ़ाता प्रयोगात्मक दृष्टिकोण रिपोर्ट.
Abstract
The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of cell proliferation underlies the pathology of diseases like cancer. As such there is great need to be able to investigate cell proliferation and quantitate the proportion of cells in each phase of the cell cycle. It is also of vital importance to indistinguishably identify cells that are replicating their DNA within a larger population. Since a cell′s decision to proliferate is made in the G1 phase immediately before initiating DNA synthesis and progressing through the rest of the cell cycle, detection of DNA synthesis at this stage allows for an unambiguous determination of the status of growth regulation in cell culture experiments.
DNA content in cells can be readily quantitated by flow cytometry of cells stained with propidium iodide, a fluorescent DNA intercalating dye. Similarly, active DNA synthesis can be quantitated by culturing cells in the presence of radioactive thymidine, harvesting the cells, and measuring the incorporation of radioactivity into an acid insoluble fraction. We have considerable expertise with cell cycle analysis and recommend a different approach. We Investigate cell proliferation using bromodeoxyuridine/fluorodeoxyuridine (abbreviated simply as BrdU) staining that detects the incorporation of these thymine analogs into recently synthesized DNA. Labeling and staining cells with BrdU, combined with total DNA staining by propidium iodide and analysis by flow cytometry1 offers the most accurate measure of cells in the various stages of the cell cycle. It is our preferred method because it combines the detection of active DNA synthesis, through antibody based staining of BrdU, with total DNA content from propidium iodide. This allows for the clear separation of cells in G1 from early S phase, or late S phase from G2/M. Furthermore, this approach can be utilized to investigate the effects of many different cell stimuli and pharmacologic agents on the regulation of progression through these different cell cycle phases.
In this report we describe methods for labeling and staining cultured cells, as well as their analysis by flow cytometry. We also include experimental examples of how this method can be used to measure the effects of growth inhibiting signals from cytokines such as TGF-β1, and proliferative inhibitors such as the cyclin dependent kinase inhibitor, p27KIP1. We also include an alternate protocol that allows for the analysis of cell cycle position in a sub-population of cells within a larger culture5. In this case, we demonstrate how to detect a cell cycle arrest in cells transfected with the retinoblastoma gene even when greatly outnumbered by untransfected cells in the same culture. These examples illustrate the many ways that DNA staining and flow cytometry can be utilized and adapted to investigate fundamental questions of mammalian cell cycle control.
Protocol
Discussion
हमारे अनुभव में, इन तकनीकों के साथ सफलता के कुछ महत्वपूर्ण नियंत्रण और प्रयोगात्मक शर्तों पर निर्भर है. एक इन प्रयोगों में इस्तेमाल के लिए एक asynchronously proliferating नियंत्रण स्थापित कर रहा है. यह नियंत्रण में तीन महत्वपूर्ण उद्देश्यों में कार्य करता है. सबसे पहले, यह सुनिश्चित करता है कि संस्कृति सभी प्रयोगात्मक नमूने के लिए इस्तेमाल किया शर्तों को उपचार के अभाव में नित्य प्रसार का समर्थन करने के लिए पर्याप्त हैं. यह नमूना भी धुंधला हो जाना करने के लिए सुनिश्चित करें कि BrdU या CD20 सकारात्मक कोशिकाओं जब वे मौजूद हैं पता लगाया जा सकता है पद्धति के लिए एक सकारात्मक नियंत्रण के उद्देश्य से कार्य करता है. अन्त में, इस नमूने प्रवाह कोशिकामापी जांचना करने के लिए प्रयोग किया जाता है. यह नियंत्रण का नमूना propidium आयोडाइड धुंधला तीव्रता समायोजित क्रमशः 200 और 400 पर 2N और 4N कोशिकाओं का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इसके अलावा, BrdU या CD20 का पता लगाने संवेदनशीलता इतना है कि नकारात्मक और सकारात्मक संकेतों के रूप में केंद्रित कर रहे हैं आंकड़े 1A और 2A में दिखाया समायोजित किया जा सकता है. जब सभी नमूनों PI – आर में एक कोशिकाओं के समान एकाग्रता हैNase समाधान है, तो कोशिकामापी के लिए कुछ समायोजन के बाद नमूनों के रूप में चलाए जा रहे हैं की जरूरत है. इस चित्र में दिखाया कारणों के लिए महत्वपूर्ण है. 4B और 5B जहां मजबूत G1 संचय अनिवार्य रूप से एक ही G1 के शिखर कि G2 / एम. के रूप में misinterpreted किया जा सकता है है बनाता है
प्रतिनिधि प्रयोगों को भी अन्य महत्वपूर्ण बिंदुओं बनाते हैं. सबसे पहले, वे दिखाना है कि BrdU तेज और लेबलिंग सेल प्रकार के बीच भिन्न हो सकते हैं. इस कारण के लिए यह महत्वपूर्ण है empirically नाड़ी और धुंधला हो जाना करने के लिए पर्याप्त रूप से एस चरण में कोशिकाओं का पता लगाने के लिए आवश्यक शर्तों की लंबाई निर्धारित. सामान्य में, सेल प्रकार है कि 24 घंटे या उससे कम में संस्कृति में डबल BrdU के साथ एक घंटे में लेबल किया जा सकता है. धीमी बढ़ती सेल प्रकार अब दालों एंटीबॉडी धुंधला शर्तों और अवधि के लिए और परिवर्तन की आवश्यकता हो सकती है. MCF10A कोशिकाओं को इस संबंध में एक उत्कृष्ट उदाहरण के रूप में वे BrdU के साथ चार घंटे और दाग के लिए दो बार के रूप में लंबे समय चार बार के लिए एंटीबॉडी के मानक एकाग्रता के साथ लेबल रहे थे. जांचकर्तासावधान रहना चाहिए BrdU के 6 घंटे से अधिक नहीं भी बहुत धीरे धीरे बढ़ कोशिकाओं के साथ लेबलिंग के रूप में इस ग़लती / G2 एम एस चरण जनसंख्या में कोशिकाओं के समावेश करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं. दूसरे, TGF-β1 उन लोगों के साथ p27KIP1 अभिव्यक्ति के प्रभाव की तुलना में, यह स्पष्ट है कि p27 या तो G1 या G2 / एम चरणों में एक संचय प्रेरित जबकि TGF-β1 संकेतन एक G1 गिरफ्तारी लाती है. 3 एच thymidine निगमन और जगमगाहट गिनती जैसे प्रसार का पता लगाने के पारंपरिक साधनों इन संभावनाओं भेद करने में असमर्थ हैं.
हमारे वैकल्पिक प्रोटोकॉल में हम एक बड़ा untransfected आबादी में कक्षों की एक उप जनसंख्या का पता लगाने के प्रदर्शित करता है. यह empirically ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं का पता लगाने के लिए सबसे उपयुक्त संवाददाता निर्धारित करने के लिए महत्वपूर्ण है. हमारे अनुभव में कुछ सेल प्रकार के या तो व्यक्त कोशिका की सतह खराब मार्करों, या ठीक से उन्हें प्लाज्मा झिल्ली यातायात, ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं का पता लगाने में असमर्थता में जिसके परिणामस्वरूप नहीं कर सकते. एलikewise, GFP की झिल्ली बाध्य फार्म बर्दाश्त नहीं सभी कोशिकाओं. का चयन सबसे उपयुक्त रिपोर्टर रिपोर्टर की अभिकर्मक दक्षता के रूप में के रूप में अच्छी तरह से untransfected नियंत्रण की तुलना में अभिव्यक्ति के रिश्तेदार तीव्रता का आकलन करने के द्वारा किया जाना चाहिए. आदर्श रूप में, इन अणुओं की heterologous अभिव्यक्ति अच्छी तरह सहन और इस विचारोत्तेजक है कि मार्कर कोशिका चक्र वितरण पर कोई प्रभाव नहीं करने के लिए थोड़ा है.
प्रवाह cytometry दृष्टिकोण के इन प्रकार की एक सीमा है कि वे केवल एक दूसरे की तुलना में कोशिका चक्र के चरणों के रिश्तेदार abundances स्थापित करने में सक्षम हैं. इस कारण से यह अस्पष्ट है अगर p27 चित्रा 3 में अभिव्यक्ति वास्तव में G1 और G2 / एम, में एक गिरफ्तारी लाती है या अगर यह सिर्फ इन चरणों एस चरण के लिए रिश्तेदार के माध्यम से प्रगति को धीमा. इन संभावनाओं कक्षों की nocodazole जैसे एक mitotic अवरोध करनेवाला, या aphidicolin तरह अवरोध करनेवाला / G1 एस के साथ एक समानांतर नमूना इलाज के द्वारा आगे की जांच कर सकते हैं. के बाद से इन दवाओं एक Domina बनाने केएम चरण में NT के गिरफ्तारी या एस चरण क्रमश: जल्दी, धीरे धीरे proliferating कोशिकाओं दवा प्रेरित गिरफ्तारी बिंदु पर जमा करेंगे. उदाहरण के लिए PRB अभिव्यक्ति की वजह से G1 में गिरफ्तार कोशिकाओं G1 में nocodazole इलाज के बावजूद रहते हुए नियंत्रण कक्ष 13 एम चरण में जमा होगा.
साथ में ले ली, इन प्रयोगात्मक दृष्टिकोण एक लचीला पद्धति है कि स्तनधारी कोशिका चक्र अनुसंधान सवालों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए लागू किया जा सकता है प्रदान करते हैं. वे आसानी से कोशिका चक्र प्रगति में परिवर्तन का पता लगाने सकता है और मतभेद जब नियंत्रण के साथ तुलना यों.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखकों के लिए स्वास्थ्य (CIHR) अनुसंधान और उनकी प्रयोगशाला में कोशिका चक्र अनुसंधान के वित्तपोषण के लिए कनाडा के कैंसर सोसायटी की कनाडा के संस्थानों धन्यवाद. MJC CIHR से एक एमडी / पीएचडी फैलोशिप के एक प्राप्तकर्ता है. MJC और एमए CaRTT प्रशिक्षण कार्यक्रम के सदस्य हैं.
Materials
| Name of the reagent/equipment | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| Cell Proliferation Labeling reagent | GE Amersham | RPN201 | |
| Anti-BrdU Antibodies | BD Biosciences | 347580 | |
| Anti-Mouse FITC conjugated Antibodies | Vector Labs | FI-2000 | |
| Cell Strain Filters | BD Falcon | 352235 | |
| Anti-CD20 Antibodies | BD Biosciences | 347673 | |
| Multi Cycle Software | Phoenix Flow Systems | N/A |
References
- Dolbeare, F., Gratzner, H., Pallavicini, M. G., Gray, J. W. Flow cytometric measurement of total DNA content and incorporated bromodeoxyuridine. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 80, 5573-5573 (1983).
- Givan, A. L. Flow cytometry: an introduction. Methods. Mol. Biol. 699, 1-1 (2011).
- Kalejta, R. F., Brideau, A. D., Banfield, B. W., Beavis, A. J. An integral membrane green fluorescent protein marker, Us9-GFP, is quantitatively retained in cells during propidium iodide-based cell cycle analysis by flow cytometry. J. Exp. Cell. Res. 248, 322-322 (1999).
- Qin, X. -. Q. The transcription factor E2F-1 is a downstream target of RB action. Molecular and Cellular Biology. 15, 742-742 (1995).
- van den Heuvel, S., Harlow, E. Distinct roles for cyclin-dependent kinases in cell cycle control. Science. 262, 2050-2050 ( ).
- Henley, S. A. A cancer derived mutation in the retinoblastoma gene with a distinct defect for LXCXE dependent interactions. Cancer Cell. Int. 10, 8-8 (2010).
- Francis, S. M. A functional connection between pRB and transforming growth factor beta in growth inhibition and mammary gland development. Mol. Cell. Biol. 29, 4455-4455 (2009).
- Isaac, C. E. The retinoblastoma protein regulates pericentric heterochromatin. Mol. Cell. Biol. 26, 3659-3659 (2006).
- Julian, L. M. Characterization of an E2F1-specific binding domain in pRB and its implications for apoptotic regulation. Oncogene. 27, 1572-1572 (2008).
- Hirschi, A. An overlapping kinase and phosphatase docking site regulates activity of the retinoblastoma protein. Nat. Struct. Mol. Biol. 17, 1051-1051 (2010).
- Dick, F. A., Dyson, N. pRB contains an E2F1-specific binding domain that allows E2F1-induced apoptosis to be regulated separately from other E2F activities. Mol. Cell. 12, 639-639 (2003).
- Dick, F. A., Sailhamer, E., Dyson, N. J. Mutagenesis of the pRB pocket reveals that cell cycle arrest functions are separable from binding to viral oncoproteins. Mol. Cell. Biol. 20, 3715-3715 (2000).
- Dick, F. A., Dyson, N. J. Three regions of the pRB pocket domain affect its inactivation by human papillomavirus E7 proteins. J. Virol. 76, 6224-6224 (2002).
