LRRK2 के kinase गतिविधि परख इन विट्रो में</em
Summary
Leucine रिच दोहराएँ kinase 2 बड़े multidomain kinase है, परिवर्तन में जो सबसे आम पार्किंसंस रोग के आनुवंशिक कारण हैं. इस प्रोटीन kinase गतिविधि का विश्लेषण करने के लिए जीव विज्ञान और इस प्रोटीन की शिथिलता को समझने में एक महत्वपूर्ण उपकरण साबित हो गया है. इस कागज में,<em> इन विट्रो में</em> LRRK2 kinase गतिविधि की परख करने की क्रिया और अपने म्यूटेंट के चयन में वर्णित है, ख्यात substrates और रोग में LRRK2 के संभावित रोग की phosphorylation की जांच के लिए एक प्रायोगिक प्रणाली प्रदान.
Abstract
Leucine Rich Repeat Kinase 2 (LRRK2) is a 2527 amino acid member of the ROCO family of proteins, possessing a complex, multidomain structure including a GTPase domain (termed ROC, for Ras of Complex proteins) and a kinase domain1. The discovery in 2004 of mutations in LRRK2 that cause Parkinson’s disease (PD) resulted in LRRK2 being the focus of a huge volume of research into its normal function and how the protein goes awry in the disease state2,3. Initial investigations into the function of LRRK2 focused on its enzymatic activities4-6. Although a clear picture has yet to emerge of a consistent alteration in these due to mutations, data from a number of groups has highlighted the importance of the kinase activity of LRRK2 in cell death linked to mutations7,8. Recent publications have reported inhibitors targeting the kinase activity of LRRK2, providing a key experimental tool9-11. In light of these data, it is likely that the enzymatic properties of LRRK2 afford us an important window into the biology of this protein, although whether they are potential drug targets for Parkinson’s is open to debate.
A number of different approaches have been used to assay the kinase activity of LRRK2. Initially, assays were carried out using epitope tagged protein overexpressed in mammalian cell lines and immunoprecipitated, with the assays carried out using this protein immobilised on agarose beads4,5,7. Subsequently, purified recombinant fragments of LRRK2 in solution have also been used, for example a GST tagged fragment purified from insect cells containing residues 970 to 2527 of LRRK212. Recently, Daniëls et al. reported the isolation of full length LRRK2 in solution from human embryonic kidney cells, however this protein is not widely available13. In contrast, the GST fusion truncated form of LRRK2 is commercially available (from Invitrogen, see table 1 for details), and provides a convenient tool for demonstrating an assay for LRRK2 kinase activity. Several different outputs for LRRK2 kinase activity have been reported. Autophosphorylation of LRRK2 itself, phosphorylation of Myelin Basic Protein (MBP) as a generic kinase substrate and phosphorylation of an artificial substrate – dubbed LRRKtide, based upon phosphorylation of threonine 558 in Moesin – have all been used, as have a series of putative physiological substrates including α-synuclein, Moesin and 4-EBP14-17. The status of these proteins as substrates for LRRK2 remains unclear, and as such the protocol described below will focus on using MBP as a generic substrate, noting the utility of this system to assay LRRK2 kinase activity directed against a range of potential substrates.
Protocol
Discussion
इस कागज LRRK2 kinase गतिविधि परख करने की क्रिया इन विट्रो प्रणाली में एक का उपयोग करने के लिए एक बुनियादी प्रोटोकॉल का वर्णन करता है. संक्षिप्तता के हितों में, इस एक घंटे के एक अंत बिंदु एक सामान्य सब्सट्रेट का उपयोग कर टेम्पलेट के लिए सीमित किया गया है, लेकिन सामान्य प्रोटोकॉल क्षमता substrates के एक श्रृंखला के लिए लागू है और अधिक परिष्कृत LRRK2 kinase गतिविधि के कैनेटीक्स जांच विश्लेषण करने के लिए उत्तरदायी है . यह इन विट्रो प्रणाली में एक का उपयोग करने के लिए एक इस तरह के रूप प्रोटीन kinase व्यवहार की जांच की कुंजी लाभ पर प्रकाश डाला गया है: क्योंकि वहाँ एंजाइम और सब्सट्रेट की सांद्रता पर पूरा नियंत्रण है, यह संभव है गतिज डेटा उत्पन्न और कश्मीर मीटर की गणना और प्रतिक्रिया के लिए वी अधिकतम मानों. अधिक विस्तृत गतिज मूल्यांकन या ख्यात inhibitors के प्रभाव के मूल्यांकन के लिए, एक उच्च throughput सिस्टम (जैसे कि LRRKtide सब्सट्रेट, Invitrogen से उपलब्ध का उपयोग करके afforded) एक बेहतर alternati हैयहाँ वर्णित दृष्टिकोण करने के लिए कर दिया है.
यह महत्वपूर्ण है, लेकिन पहचान, कि न्यूनकारी मॉडल इन विट्रो kinase assays में द्वारा प्रदान की व्यवस्था है, लेकिन एक kinase और संभावित substrates के साथ अपने संबंधों के जीव विज्ञान की जांच करने के लिए एक उपकरण. इस तरह के रूप में assays से डेटा अन्य दृष्टिकोण के साथ संयोजन के रूप में इस्तेमाल किया जाना चाहिए कैसे एक kinase इन विट्रो में और एक सेलुलर संदर्भ में व्यवहार करता है की एक व्यापक तस्वीर प्राप्त करने के लिए. उदाहरण के लिए, इन विट्रो में एक ख्यात phosphorylated सब्सट्रेट मास स्पेक्ट्रोमेट्री से विश्लेषण किया जा सकता है संभव phosphosites है कि तब लक्षित mutagenesis (जैसे परिवर्तित. सेरीन या threonine फॉस्फेट alanine जैसे कोई भी phosphorylatable अवशेषों को स्वीकर्ता अवशेषों) से छेड़छाड़ किया जा सकता है कार्यात्मक जांच की पहचान phosphorylation पूर्व vivo के परिणाम.
इस तरह के रूप में एक में इन विट्रो परख प्रणाली से डेटा की व्याख्या में एक प्रमुख विचार eithe की संभावना हैr प्रकार मैं या प्रकार द्वितीय त्रुटियों (झूठी सकारात्मक या नकारात्मक झूठी). इस प्रणाली के न्यूनकारी प्रकृति दुर्भाग्य से यह दोनों के लिए disposes – पूर्व के मामले में, एक शुद्ध ख्यात सब्सट्रेट और कृत्रिम करीब निकटता में और उच्च एकाग्रता में शुद्ध kinase (सेलुलर परिवेश की तुलना) artefactual phosphorylation घटनाओं में परिणाम कर सकते हैं. इसके विपरीत, कई kinases सेल के संदर्भ में एक परिसर के भाग के रूप में कार्य है, और किसी दिए गए होते हैं सब्सट्रेट के phosphorylation के लिए सह कारकों की आवश्यकता है. जैसा कि ऊपर उल्लेख किया, एक ख्यात सब्सट्रेट की phosphorylation से एक सकारात्मक परिणाम के इन विट्रो परख प्रणाली में एक का उपयोग कर तो एक सेलुलर प्रणाली में परीक्षण किया जाना चाहिए करने के लिए परिणाम को मान्य करने के लिए, और एक नकारात्मक परिणाम सावधानी के साथ व्याख्या की जानी चाहिए.
इस के प्रकाश में, यह जहाँ महत्वपूर्ण सकारात्मक और नकारात्मक दोनों नियंत्रण के लिए ब्याज की अपने kinase की गतिविधि का एक तुलनात्मक अध्ययन की अनुमति संभव है. एक सकारात्मक विवाद का चयन सावधानी सेएल है कि कि अपने ख्यात सब्सट्रेट phosphorylate की संभावना नहीं है एक नकारात्मक नियंत्रण के साथ साथ ब्याज की अपने प्रोटीन की दिशा में एक ज्ञात गतिविधि है, अत्यंत मूल्यवान है. LRRK2 के लिए एक उम्मीदवार नियंत्रण रिसेप्टर बातचीत 3 kinase, जो LRRK2 के kinase डोमेन के लिए एक निकट से संबंधित प्राथमिक अनुक्रम है, लेकिन एक बहुत अलग समग्र डोमेन 18 संरचना है. यह Invitrogen से पुनः संयोजक प्रोटीन के रूप में उपलब्ध है और हमारी प्रयोगशाला में एक मानक नियंत्रण के रूप में प्रयोग किया जाता है.
यह भी नोट किया जाना चाहिए कि LRRK2 के व्यावसायिक रूप से उपलब्ध फार्म प्रोटीन एन टर्मिनस अभाव है और Glutathione एस transferase और यह एक संभावित confounding कारक के रूप में ध्यान में रखा जाना चाहिए जब इस प्रोटीन के साथ kinase assays ले जाने के साथ टैग, के रूप में यह ज्ञात नहीं है क्या भूमिका LRRK2 के एन टर्मिनल इस प्रोटीन की सामान्य समारोह में निभा सकते हैं. अगर, उदाहरण के लिए, LRRK2 के एन टर्मिनल भाग है कि प्रोटीन में अनुपस्थित है इस प्रोटोकॉल में प्रयोग किया जाताLRRK2 के kinase डोमेन के लिए एक विशिष्ट सब्सट्रेट की भर्ती के लिए महत्वपूर्ण है तो इस के मनाया phosphorylation पर एक बड़ा असर पड़ेगा ने कहा कि इन विट्रो प्रणाली में सब्सट्रेट ऊपर वर्णित है.
इन निरंतर के साथ भी, तथापि, एक में इन विट्रो सेटिंग में इस प्रोटीन के व्यवहार की जांच के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण के रूप में पार्किंसंस अनुसंधान में LRRK2 के जीव विज्ञान से जुड़ी महत्व इस प्रोटोकॉल की उपयोगिता पर प्रकाश डाला गया.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक एक पार्किंसंस ब्रिटेन रिसर्च फैलो (F1002 अनुदान). इस काम के हिस्से में वेलकम ट्रस्ट / MRC neurodegeneration पुरस्कार संयुक्त कॉल (WT089698) ब्रिटेन पार्किंसंस रोग कंसोर्टियम (UKPDC) जिसके सदस्य तंत्रिका विज्ञान के UCL संस्थान, शेफ़ील्ड विश्वविद्यालय और MRC प्रोटीन phosphorylation यूनिट में से हैं द्वारा समर्थित किया गया डंडी विश्वविद्यालय.
Materials
| Reagent | Company | Catalogue Number | Comment |
| LRRK2 wild type | Invitrogen | PV4873 | |
| LRRK2 G2019S | Invitrogen | PV4881 | |
| LRRK2 D1994A | Invitrogen | PV6051 | |
| Kinase buffer | Cell Signalling | 9802S | |
| MBP | Sigma | M1891 | |
| 32P g ATP | Perkin Elmer | BLU002X500UC | 500µCi, 30Ci /mMole |
| 4x LDS sample buffer | Invitrogen | NP0007 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M6250 | |
| Protein standards | Invitrogen | LC5800 | |
| MOPS running buffer | Invitrogen | NP0001 | |
| Bis-tris acrylamide gel | Invitrogen | NP0321 | 4-12% 1mm 10well |
| PVDF membrane | Millipore | IPVH00010 | |
| Transfer buffer | Invitrogen | NP0006 |
Table 1. Reagents
Distilled and de-ionized water was used for all dilution steps
| Equipment type | Company | Comment |
| Geiger counter | Mini Instruments | |
| SDS PAGE tank | Invitrogen | |
| Transfer tank | Invitrogen | |
| Heat blocks (2) | Eppendorf | |
| Phosphor screen | GE | X-ray film can be substituted |
| Phosphor imager | GE | |
| Exposure cassette | GE | |
| Centrifuge | Eppendorf | |
| Perspex shielding | ||
| 1.5ml tubes | VWR | Screw top with O ring |
Table 2. Equipment
References
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