Leucin Rich Repeat Kinase 2 är en stor multidomain kinas, mutationer som är den vanligaste genetiska orsaken till Parkinsons sjukdom. Analys av kinase aktiviteten hos detta protein har visat sig vara ett viktigt verktyg för att förstå biologi och dysfunktion av detta protein. I detta papper,<em> In vitro</em> Testmetoder för kinase aktiviteten hos LRRK2 och ett urval av sina mutanter beskrivs, vilket ger ett experimentellt system för att undersöka fosforylering av förmodade substrat och potentiella dysfunktion av LRRK2 i sjukdomen.
Leucin Rich Repeat Kinase 2 (LRRK2) är en 2527 aminosyra medlem av ROCO familj av proteiner, som har en komplex, multidomain strukturer, inklusive en GTPase domän (sk ROC, för Ras av komplexa proteiner) och ett kinas domän 1. Upptäckten år 2004 av mutationer i LRRK2 som orsakar Parkinsons sjukdom (PS) resulterade i LRRK2 vara i fokus för en stor mängd forskning om sin normala funktion och hur proteinet går snett i det sjukdomstillstånd 2,3. Inledande undersökningar av funktion LRRK2 fokuserade på sin enzymaktiviteten 4-6. Även om en klar bild har ännu inte dyka upp av en konsekvent förändring i dessa på grund av mutationer, har data från ett antal grupper betonade vikten av kinas aktivitet LRRK2 i celldöd kopplade till mutationer 7,8. Senaste publikationer har rapporterat hämmare med inriktning på kinase aktiviteten hos LRRK2, vilket ger en viktig experimentell verktyg 9-11. Mot bakgrund av dessa uppgifter, detär troligt att den enzymatiska egenskaper LRRK2 ger oss ett viktigt fönster mot biologi detta protein, även om de är potentiella målproteiner för Parkinsons är öppen för debatt.
Ett antal olika metoder har använts för att analysen av kinasaktivitet av LRRK2. Inledningsvis var analyser utförs med hjälp epitop taggade proteinet överuttryckt i däggdjursceller cellinjer och immunoprecipitated, med analyser utförs med hjälp av detta protein immobiliserade på agaros pärlor 4,5,7. Därefter har renat rekombinant fragment av LRRK2 i lösning också använts, till exempel en GST taggad fragment renat från insektsceller innehåller rester från 970 till 2527 av LRRK2 12. Nyligen rapporterade Daniëls et al. Isolering av full längd LRRK2 i lösning från mänskliga embryonala njur celler, men detta protein är inte allmänt tillgängliga 13. Däremot GST fusion stympad form av LRRK2 är kommersiellt tillgänglig före (från Invitrogen, se tabell 1 för detaljer), och erbjuder ett praktiskt verktyg för demonstration av en assay för LRRK2 kinasaktivitet. Flera olika utgångar för LRRK2 kinasaktivitet har rapporterats. Autophosphorylation av LRRK2 själv, fosforylering av myelin Basic Protein (MBP) som en generisk kinas substrat och fosforylering av ett artificiellt substrat – dubbad LRRKtide, baserat på fosforyleringen av treonin 558 i Moesin – alla har använts, som har en rad förmodad fysiologiska substrat bland annat α-synuklein, Moesin och 4-EBP 14-17. Statusen av dessa proteiner som substrat för LRRK2 förblir oklar, och som sådan protokollet som beskrivs nedan kommer att fokusera på att använda MBP som en allmän substrat, notera nyttan av detta system för analys LRRK2 kinasaktivitet riktad mot en rad möjliga underlag.
Detta dokument beskriver ett grundläggande protokoll för testmetoder för att kinase aktiviteten hos LRRK2 använda en in vitro-system. I syfte att korta, har detta varit begränsade till en timmes slutpunkt mall med hjälp av en generisk substrat, men den allmänna protokoll gäller för en rad möjliga substrat och mottaglig för mer sofistikerade analyser undersöka kinetik för kinase aktiviteten hos LRRK2 . Detta belyser en av de viktigaste fördelarna med att använda en in vitro-system för att undersöka kinas beteende av ett protein som denna: eftersom det inte finns fullständig kontroll över koncentrationerna av enzym och substrat, är det möjligt att generera kinetiska data och beräkna K m och V max värden för reaktion. För mer detaljerad kinetisk utvärderingar eller utvärdera effekten av förmodade hämmare, är en högre genomströmning system (t.ex. som den som ges med hjälp av LRRKtide substrat, tillgänglig från Invitrogen) en överlägsen alternative den strategi som beskrivs här.
Det är dock viktigt att inse att det reduktionistiska modell som levereras av in vitro-kinas-analyser är bara ett verktyg för att undersöka biologi ett kinas och dess relationer med potentiella substrat. Data från analyser som denna bör användas i kombination med andra metoder att få en övergripande bild av hur ett kinas beter sig in vitro och in en cellulär sammanhang. Till exempel kan en förmodad substrat fosforyleras in vitro analyseras med masspektrometri för att identifiera möjliga phosphosites som sedan kan manipuleras genom riktade mutagenes (t ex. Konvertera serin eller treonin fosfat rester acceptanten till ingen-phosphorylatable restprodukter som alanin) för att undersöka den funktionella Konsekvenserna av fosforylering ex vivo.
En väsentlig aspekt i tolkningen av data från ett in vitro system som detta är sannolikheten för either typ I eller typ II (falskt positiva eller falskt negativa) fel. Den reduktionistiska natur detta system tyvärr avsätter till båda – i fallet med den förra, med ett renat förmodad substrat och renas kinas i konstgjort närhet och vid hög koncentration (jämfört med den cellulära miljön) kan resultera i artefactual fosforylering händelser. Omvänt många kinaser fungera som del av ett komplext inom ramen för cellen, och kräver co-faktorer för fosforylering av ett visst substrat uppstå. Som nämnts ovan, ett positivt resultat fosforyleringen av en förmodad substrat med hjälp av ett in vitro-system ska sedan testas i ett mobilnät för att validera resultat och ett negativt resultat bör tolkas med försiktighet.
Mot denna bakgrund är det viktigt där det är möjligt att ha både positiva och negativa kontroller för att möjliggöra en jämförande studie av verksamheten i din kinas av intresse. Noggrant urval av en positiv control som har en känd aktivitet mot ditt protein av intresse, tillsammans med en negativ kontroll som är osannolikt att fosforylera din förmodade substrat, är oerhört värdefullt. En kandidat kontroll för LRRK2 är Receptor interagerar kinas 3, som har ett nära samband primär sekvensen till kinase domän LRRK2 men har en helt annan övergripande domänstruktur 18. Det finns som rekombinant protein från Invitrogen och används som en standard kontroll i vårt laboratorium.
Det bör också noteras att de kommersiellt tillgängliga formen av LRRK2 saknar N-terminalen av det protein och är märkta med glutation-S-transferas och detta bör beaktas som en möjlig påverkande faktor när de utför kinas försök med detta protein, eftersom det inte är känt vilken roll N-terminal LRRK2 får spela i den normala funktionen av detta protein. Om till exempel, N-terminalen del av LRRK2 som saknas i det protein som används i detta protokollär avgörande för rekryteringen av en viss råvara till kinase domän LRRK2 kommer detta att få stor inverkan på de noterade fosforyleringen av sade substrat i in vitro-system som beskrivs ovan.
Även med dessa förbehåll, betonar dock vikten av att biologi LRRK2 vid Parkinsons forskning nyttan av detta protokoll som ett värdefullt verktyg för att undersöka beteendet hos detta protein i en in vitro inställning.
The authors have nothing to disclose.
Författaren är en Parkinsons brittiska Research Fellow (bidrag F1002). Detta arbete stöddes delvis av Wellcome Trust / MRC gemensam utlysning inom neurodegeneration Award (WT089698) till Storbritannien Parkinsons sjukdom Consortium (UKPDC) vars medlemmar är från UCL Institute of Neurology, University of Sheffield och MRC proteinfosforylering enheten vid University of Dundee.
Reagent | Company | Catalogue Number | Comment |
LRRK2 wild type | Invitrogen | PV4873 | |
LRRK2 G2019S | Invitrogen | PV4881 | |
LRRK2 D1994A | Invitrogen | PV6051 | |
Kinase buffer | Cell Signalling | 9802S | |
MBP | Sigma | M1891 | |
32P g ATP | Perkin Elmer | BLU002X500UC | 500µCi, 30Ci /mMole |
4x LDS sample buffer | Invitrogen | NP0007 | |
2-Mercaptoethanol | Sigma | M6250 | |
Protein standards | Invitrogen | LC5800 | |
MOPS running buffer | Invitrogen | NP0001 | |
Bis-tris acrylamide gel | Invitrogen | NP0321 | 4-12% 1mm 10well |
PVDF membrane | Millipore | IPVH00010 | |
Transfer buffer | Invitrogen | NP0006 |
Table 1. Reagents
Distilled and de-ionized water was used for all dilution steps
Equipment type | Company | Comment |
Geiger counter | Mini Instruments | |
SDS PAGE tank | Invitrogen | |
Transfer tank | Invitrogen | |
Heat blocks (2) | Eppendorf | |
Phosphor screen | GE | X-ray film can be substituted |
Phosphor imager | GE | |
Exposure cassette | GE | |
Centrifuge | Eppendorf | |
Perspex shielding | ||
1.5ml tubes | VWR | Screw top with O ring |
Table 2. Equipment