هذا هو بروتوكول لعزل نشط كينيسين طول كامل من<em> ذبابة الفاكهة</em> الأجنة لواحدة جزيء دراسات البيوفيزيائية. نبين كيفية جمع الأجنة، وجعل المحللة جنين، وتتبلمر ثم ميكروتثبول (MTS). يتم تنقيته بواسطة شل حركة كينيسين على النظام التجاري المتعدد الأطراف، والغزل أسفل المجمعات كينيسين-طن متري، ومن ثم الافراج عن كينيسين من النظام التجاري المتعدد الأطراف عن طريق إضافة للاعبي التنس المحترفين.
البروتينات محرك نقل الشحنات على طول الأنابيب الدقيقة، ونقلهم إلى مواقع فرعية الخلوية محددة. ولأن يقترح نقل تغييرها لتشكل أساس مجموعة متنوعة من أمراض الاعصاب، فهم نقل أنيبيب محرك أساس ولائحته من المرجح أن يؤدي في نهاية المطاف إلى تحسين الطرق العلاجية. كينيسين-1 هو بروتين محرك حقيقية النواة التي تتحرك في اتجاه تقدمي (زائد النهاية) على طول الأنابيب الدقيقة (MTS)، والمدعوم من التحلل المائي للاعبي التنس المحترفين. نحن هنا نورد بروتوكول تنقية مفصل لعزل نشط كينيسين طول كامل من أجنة ذبابة الفاكهة، مما يسمح للمزيج من الوراثة ذبابة الفاكهة مع دراسات البيوفيزيائية واحدة جزيء. بداية مع ما يقرب من 50 أكواب زرع، مع ما يقرب من 1000 من الإناث في الكأس، وأجرينا مجموعات بين عشية وضحاها. قدمت هذا ما يقرب من 10 مل من أجنة معبأة. وكانت الأجنة تبييض dechorionated (استسلام حوالي 9 غرامات من الأجنة)، وبعد ذلك المتجانس. AFثالثا انقطاع، وأوضح أن جناسة باستخدام تدور بسرعة منخفضة تليها الطرد المركزي عالية السرعة. تمت معالجة طاف مع توضيح GTP والتاكسول إلى تتبلمر MTS. وثبتوا على النظام التجاري المتعدد الأطراف كينيسين بلمرة بإضافة التناظرية للاعبي التنس المحترفين، 5'-أدينيليل imidodiphosphate في درجة حرارة الغرفة. بعد ملزم كينيسين، وsedimented ميكروتثبول عن طريق الطرد المركزي بسرعة عالية من خلال وسادة السكروز. وكان بيليه أنيبيب ثم إعادة وقف التنفيذ، وتكررت هذه العملية. أخيرا، تمت إضافة للاعبي التنس المحترفين للافراج عن كينيسين من النظام التجاري المتعدد الأطراف. ارتفاع سرعة الطرد المركزي نسج ثم تراجع النظام التجاري المتعدد الأطراف، وترك كينيسين في طاف. وقد تعرض هذا كينيسين لترشيح الطرد المركزي باستخدام قطع 100 دينار كويتي من مرشح لمزيد من تنقية، aliquoted، المفاجئة مجمدة في النيتروجين السائل، وتخزينها في -80 درجة مئوية. تم تنفيذ SDS هلام الكهربائي والغربية النشاف باستخدام عينة تنقيته. والنشاط الحركي للعينات تنقيته قبل وبعد خطوة الترشيح الطرد المركزي النهائيتم تقييم استخدام واحد في المختبر فحص جزيء أنيبيب. وأظهرت الكسور كينيسين قبل وبعد الترشيح الطرد المركزي processivity كما ذكرت سابقا في الأدب. تجارب أخرى تجرى حاليا لتقييم التفاعل بين كينيسين وبروتينات النقل الأخرى ذات الصلة.
الدماغ البقري هو المادة الأكثر استخداما على نطاق واسع بدءا من 11 إلى تنقية كاملة الطول كينيسين، على الرغم من واستخدمت في الدماغ الفئران وكذلك 12. والعيب الكبير في استخدام الدماغ البقري كمصدر كينيسين هو توافر المواد الطازجة بدءا: المسالخ وعادة ما تكون غير ق?…
The authors have nothing to disclose.
شكر خاص لنجاي وجايسون كريس ديل ريو لما قدموه من دعم ومساعدة في هذا المشروع. وأيد هذا العمل من قبل RO1 منحة GM070676 إلى الإشتراكي.
Name of the reagent or material | Company | Catalogue number | Comments |
Agar (Granulated) | Fisher | 1423-500 | |
Dextrose (D-Glucose) Anhydrous | Fisher | D16-3 | |
Petri Dishes | Becton | 35 1007 | 60x15mm Style (Polyester) 20/bag |
Drosophila Culture Vials | UCI | ||
Tricorn beaker | Econo Lab Inc. | B700-100 | Volume:100ml, size: 58x72mm |
Yeast | Red Star | 2751 | |
Nylon Mesh | Genesse Scientific | 57-102 | 120 micron pore size |
Nylon Mesh | Small Parts | 06-350/35 | |
Pipes | Sigma | 108321-27-3 | |
Pipes | Sigma | 108321-27-3 | |
Glycerol | Fisher | 56-81-5 | |
EGTA | Sigma | 67-42-5 | |
MgS04(Anhydrous) | Fisher | 7487-88-9 | |
PMSF | Sigma | 329-98-6 | |
Leupeptin | Sigma | 103476-89-7 | |
Aprotonin | Sigma | 9087-70-1 | |
TAME | Sigma | 178403-8 | |
STI | Calbiochem | 65635 | |
GTP | Sigma | 36051-31-7 | |
Taxol | Sigma | 33069-62-4 | |
ATP analog 5′-adenylyl imidodiphosphate | Sigma | 3605-31-7 | |
NaCl | Mallinckrodt | 7647-14-5 | |
ATP | Sigma | 74804-12-9 | |
Amicon Ultra Centrifugal Filters: .5 mL, 100kD cut off, 8 pack | Millipore | UFC510008 |