العزلة وتنقية كينيسين من ذبابة الفاكهة الأجنة
Summary
هذا هو بروتوكول لعزل نشط كينيسين طول كامل من<em> ذبابة الفاكهة</em> الأجنة لواحدة جزيء دراسات البيوفيزيائية. نبين كيفية جمع الأجنة، وجعل المحللة جنين، وتتبلمر ثم ميكروتثبول (MTS). يتم تنقيته بواسطة شل حركة كينيسين على النظام التجاري المتعدد الأطراف، والغزل أسفل المجمعات كينيسين-طن متري، ومن ثم الافراج عن كينيسين من النظام التجاري المتعدد الأطراف عن طريق إضافة للاعبي التنس المحترفين.
Abstract
البروتينات محرك نقل الشحنات على طول الأنابيب الدقيقة، ونقلهم إلى مواقع فرعية الخلوية محددة. ولأن يقترح نقل تغييرها لتشكل أساس مجموعة متنوعة من أمراض الاعصاب، فهم نقل أنيبيب محرك أساس ولائحته من المرجح أن يؤدي في نهاية المطاف إلى تحسين الطرق العلاجية. كينيسين-1 هو بروتين محرك حقيقية النواة التي تتحرك في اتجاه تقدمي (زائد النهاية) على طول الأنابيب الدقيقة (MTS)، والمدعوم من التحلل المائي للاعبي التنس المحترفين. نحن هنا نورد بروتوكول تنقية مفصل لعزل نشط كينيسين طول كامل من أجنة ذبابة الفاكهة، مما يسمح للمزيج من الوراثة ذبابة الفاكهة مع دراسات البيوفيزيائية واحدة جزيء. بداية مع ما يقرب من 50 أكواب زرع، مع ما يقرب من 1000 من الإناث في الكأس، وأجرينا مجموعات بين عشية وضحاها. قدمت هذا ما يقرب من 10 مل من أجنة معبأة. وكانت الأجنة تبييض dechorionated (استسلام حوالي 9 غرامات من الأجنة)، وبعد ذلك المتجانس. AFثالثا انقطاع، وأوضح أن جناسة باستخدام تدور بسرعة منخفضة تليها الطرد المركزي عالية السرعة. تمت معالجة طاف مع توضيح GTP والتاكسول إلى تتبلمر MTS. وثبتوا على النظام التجاري المتعدد الأطراف كينيسين بلمرة بإضافة التناظرية للاعبي التنس المحترفين، 5'-أدينيليل imidodiphosphate في درجة حرارة الغرفة. بعد ملزم كينيسين، وsedimented ميكروتثبول عن طريق الطرد المركزي بسرعة عالية من خلال وسادة السكروز. وكان بيليه أنيبيب ثم إعادة وقف التنفيذ، وتكررت هذه العملية. أخيرا، تمت إضافة للاعبي التنس المحترفين للافراج عن كينيسين من النظام التجاري المتعدد الأطراف. ارتفاع سرعة الطرد المركزي نسج ثم تراجع النظام التجاري المتعدد الأطراف، وترك كينيسين في طاف. وقد تعرض هذا كينيسين لترشيح الطرد المركزي باستخدام قطع 100 دينار كويتي من مرشح لمزيد من تنقية، aliquoted، المفاجئة مجمدة في النيتروجين السائل، وتخزينها في -80 درجة مئوية. تم تنفيذ SDS هلام الكهربائي والغربية النشاف باستخدام عينة تنقيته. والنشاط الحركي للعينات تنقيته قبل وبعد خطوة الترشيح الطرد المركزي النهائيتم تقييم استخدام واحد في المختبر فحص جزيء أنيبيب. وأظهرت الكسور كينيسين قبل وبعد الترشيح الطرد المركزي processivity كما ذكرت سابقا في الأدب. تجارب أخرى تجرى حاليا لتقييم التفاعل بين كينيسين وبروتينات النقل الأخرى ذات الصلة.
Protocol
Discussion
الدماغ البقري هو المادة الأكثر استخداما على نطاق واسع بدءا من 11 إلى تنقية كاملة الطول كينيسين، على الرغم من واستخدمت في الدماغ الفئران وكذلك 12. والعيب الكبير في استخدام الدماغ البقري كمصدر كينيسين هو توافر المواد الطازجة بدءا: المسالخ وعادة ما تكون غير ق?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
شكر خاص لنجاي وجايسون كريس ديل ريو لما قدموه من دعم ومساعدة في هذا المشروع. وأيد هذا العمل من قبل RO1 منحة GM070676 إلى الإشتراكي.
Materials
| Name of the reagent or material | Company | Catalogue number | Comments |
| Agar (Granulated) | Fisher | 1423-500 | |
| Dextrose (D-Glucose) Anhydrous | Fisher | D16-3 | |
| Petri Dishes | Becton | 35 1007 | 60x15mm Style (Polyester) 20/bag |
| Drosophila Culture Vials | UCI | ||
| Tricorn beaker | Econo Lab Inc. | B700-100 | Volume:100ml, size: 58x72mm |
| Yeast | Red Star | 2751 | |
| Nylon Mesh | Genesse Scientific | 57-102 | 120 micron pore size |
| Nylon Mesh | Small Parts | 06-350/35 | |
| Pipes | Sigma | 108321-27-3 | |
| Pipes | Sigma | 108321-27-3 | |
| Glycerol | Fisher | 56-81-5 | |
| EGTA | Sigma | 67-42-5 | |
| MgS04(Anhydrous) | Fisher | 7487-88-9 | |
| PMSF | Sigma | 329-98-6 | |
| Leupeptin | Sigma | 103476-89-7 | |
| Aprotonin | Sigma | 9087-70-1 | |
| TAME | Sigma | 178403-8 | |
| STI | Calbiochem | 65635 | |
| GTP | Sigma | 36051-31-7 | |
| Taxol | Sigma | 33069-62-4 | |
| ATP analog 5′-adenylyl imidodiphosphate | Sigma | 3605-31-7 | |
| NaCl | Mallinckrodt | 7647-14-5 | |
| ATP | Sigma | 74804-12-9 | |
| Amicon Ultra Centrifugal Filters: .5 mL, 100kD cut off, 8 pack | Millipore | UFC510008 |
References
- Ashburner, M., Thompson, J. N., Ashburner, M., Wright, T. R. F. The laboratory culture of Drosophila 2A. The genetics and biology of Drosophila. , 1-81 (1978).
- Roberts, D. B. . Drosophila: A Practical Approach. , (1998).
- Kunert, N., Brehm, A. Mass production of Drosophila Embryosand Chromatographic Purification of Native Protein Complexes. Methods in Molecular Biology. 420, 359 (2008).
- Goldstein, L. S. B., Fyrberg, E. A., Wilson, L., Matsudaira, P. T., Eds, . Drosophila melanogaster: Practical Uses in Cell and Molecular Biology. Methods in Cell Biology. 44, (1994).
- Saxton, W. M. Drosophila kinesin: Characterization of microtubule motility and ATPase. Proceedings of the National Academy of Science. 85, 1109 (1988).
- Shubeita, G. Consequences of motor copy number on the intracellular transport of kinesin-1-driven lipid droplets. Cell. 135, 1098-1098 (2008).
- Svoboda, K., Block, S. M. Force and Velocity Measured for Single Kinesin Molecules. Cell. 77, 773 (1994).
- Cole, D. G., Saxton, W. M., Sheehan, K. B., Scholey, J. M. A “Slow” Homotetrameric Kinesin-related Motor Protein Purified from Drosophila embryos. J. Biol. Chem. 269, 22917-22917 (1994).
- Saxton, W. M. Isolation and Analysis of Microtuble Motor Proteins. Drosophila Melanogaster. Bloomington: Academic. 44, 279 (1994).
- Scholey, J. Motility Assay for Motor Proteins. Methods in Cell Biology. 39, 138 (1993).
- Wagner, M. C., Pfister, K., Brody, S., Bloom, G. Purification of kinesin from bovine brain and assay of microtubule-stimulated ATPase activity. Methods in Enzymology. 196, 157 (1991).
- Aizawa, H. Kinesin Family in Murine Nerwous System. The Journal of Cell Biology. 119, 1287-1287 (1992).
- Ori-McKenney, K. M., Xu, J., Gross, S. P., Vallee, R. B. A cytoplasmic dynein tail mutation impairs motor processivity. Nature Cell Biology. 12, 1228-1228 (2010).
