Isolement et purification de la kinésine de Drosophila Embryons
Summary
Il s'agit d'un protocole d'isoler actif Kinesin pleine longueur à partir de<em> Drosophila</em> Embryons pour une seule molécule d'études biophysiques. Nous montrons comment collecter les embryons, faire le lysat d'embryons, puis polymériser microtubules (MTs). Kinesin est purifié par l'immobiliser sur le SCM, la filature par les complexes Kinesin-MT, puis en relâchant la kinésine de la MT par addition d'ATP.
Abstract
Protéines motrices transporter des marchandises le long des microtubules, et les transporter à des sous-cellulaires endroits. Parce que le transport modifié est proposé à la base une variété de maladies neurodégénératives, la compréhension des microtubules du transport basé à moteur et de son règlement sera probablement finalement conduire à l'amélioration des approches thérapeutiques. Kinésine-1 est une protéine eucaryote moteur qui se déplace dans une direction antérograde (plus fin) le long des microtubules (MT), généré par hydrolyse de l'ATP. Nous rapportons ici un protocole de purification pour isoler détaillée actif kinésine pleine longueur à partir d'embryons de drosophile, ce qui permet la combinaison de génétique de la Drosophile avec une seule molécule d'études biophysiques. À partir avec environ 50 tasses de pose, avec environ 1000 femmes par tasse, nous avons réalisé des collections pendant la nuit. Cela a fourni environ 10 ml d'embryons emballés. Les embryons ont été l'eau de Javel dechorionated (ce qui donne environ 9 grammes d'embryons), puis homogénéisé. Afperturbations ter, l'homogénat a été précisé en utilisant une vitesse d'essorage à faible suivie d'une centrifugation à grande vitesse. Le surnageant clarifié a été traitée avec GTP et le taxol à polymériser MT. Kinésine a été immobilisé sur polymérisé par addition MT l'analogue de l'ATP, 5'-adénylate imidodiphosphate à la température ambiante. Après kinésine contraignant, les microtubules ont été sédimentées par centrifugation à grande vitesse grâce à un coussin de saccharose. Le culot a été microtubules ensuite remis en suspension, et ce processus a été répété. Enfin, l'ATP a été ajouté à libérer la kinésine de la MT. Centrifugation à grande vitesse, puis filé vers le bas de la MT, laissant la kinésine dans le surnageant. Cette kinésine a été soumis à une filtration centrifuge en utilisant une réduction de 100 KD hors du filtre pour une purification supplémentaire, aliquotés, enclenchez congelés dans l'azote liquide, et conservés à -80 ° C. Électrophorèse sur gel SDS et western blot a été réalisée en utilisant l'échantillon purifié. L'activité motrice des échantillons purifiés avant et après l'étape finale de filtration centrifugea été évaluée en utilisant un test in vitro molécule microtubules unique. Les fractions kinésine avant et après la filtration centrifuge montré processivité comme précédemment rapporté dans la littérature. D'autres expériences sont en cours pour évaluer l'interaction entre kinésine et autres protéines de transport connexes.
Protocol
Discussion
Cerveau bovin est le matériau le plus utilisé à partir du 11 pour purifier pleine longueur kinésine, si le cerveau murin a été utilisé comme puits 12. Un inconvénient important de l'aide cerveau bovin comme source kinésine est la disponibilité de matériau de départ fraîche: les abattoirs sont généralement inaccessibles, et le cerveau doit être extrêmement frais afin d'obtenir kinésine active. En outre, seuls les cerveaux des jeunes vaches sont efficaces. Enfin, la manipula…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Un merci spécial à Kris Ngai et Jason Del Rio pour leur soutien et leur aide dans ce projet. Ce travail a été soutenu par RO1 subvention GM070676 à SPG.
Materials
| Name of the reagent or material | Company | Catalogue number | Comments |
| Agar (Granulated) | Fisher | 1423-500 | |
| Dextrose (D-Glucose) Anhydrous | Fisher | D16-3 | |
| Petri Dishes | Becton | 35 1007 | 60x15mm Style (Polyester) 20/bag |
| Drosophila Culture Vials | UCI | ||
| Tricorn beaker | Econo Lab Inc. | B700-100 | Volume:100ml, size: 58x72mm |
| Yeast | Red Star | 2751 | |
| Nylon Mesh | Genesse Scientific | 57-102 | 120 micron pore size |
| Nylon Mesh | Small Parts | 06-350/35 | |
| Pipes | Sigma | 108321-27-3 | |
| Pipes | Sigma | 108321-27-3 | |
| Glycerol | Fisher | 56-81-5 | |
| EGTA | Sigma | 67-42-5 | |
| MgS04(Anhydrous) | Fisher | 7487-88-9 | |
| PMSF | Sigma | 329-98-6 | |
| Leupeptin | Sigma | 103476-89-7 | |
| Aprotonin | Sigma | 9087-70-1 | |
| TAME | Sigma | 178403-8 | |
| STI | Calbiochem | 65635 | |
| GTP | Sigma | 36051-31-7 | |
| Taxol | Sigma | 33069-62-4 | |
| ATP analog 5′-adenylyl imidodiphosphate | Sigma | 3605-31-7 | |
| NaCl | Mallinckrodt | 7647-14-5 | |
| ATP | Sigma | 74804-12-9 | |
| Amicon Ultra Centrifugal Filters: .5 mL, 100kD cut off, 8 pack | Millipore | UFC510008 |
References
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