ディテールに秘められたゼブラフィッシュ胚心臓の免疫染色

サマリー

ゼブラフィッシュ胚の心臓の免疫染色を実施する迅速な方法が説明されています。全体のマウント免疫染色の手法に比べ、この方法は劇的に非常に低下処理時間内に心臓の細胞/細胞内構造を明らかに高解像度の画像を得ることができる抗体の浸透を、増加させる。

要約

ゼブラフィッシュの胚は、心臓の開発とその有利な発生学と遺伝学^1,2のために人間の心の病気を研究するためのin vivoで脊椎動物のモデルで人気となる。約100-200胚は、成魚の単一ペアから毎週容易に入手可能である。 EX子宮を開発透明な胚は、心臓の欠陥^3を評価するために最適です。任意の遺伝子の発現は、モルホリノ技術またはRNAの注射^4を介して操作することができます。また、前方に遺伝子スクリーニングは、すでに心臓発生⁵の様々な観点に影響を与える変異体のリストを生成している。

全体のマウント免疫染色では、特定の組織⁶に標的タンパク質の発現パターンを明らかにするためには、この動物モデルにおいて重要なテクニックです。しかし、携帯電話または細胞内構造を明らかにすることができる高解像度の画像は、主に物理的なlocatに、難しい状態が続いている心と抗体のほとんど通過のイオン。

ここで、我々は最初の心臓を解剖し、顕微鏡スライドの表面に染色処理を行うことにより、これらのボトルネックに対処する方法を提示する。小さな心臓サンプルの損失を防ぐために、ソリューションの取り扱いを容易にするために、我々はimmEdgeのペンによって描画される顕微鏡の表面をスライド上に円の中で心臓のサンプルを制限。染色後、蛍光シグナルを直接複合顕微鏡で観察することができます。

胚魚の心臓は、わずか数細胞層で構成されて以来、私たちの新しいメソッドは、抗体の浸透を大幅に向上します。無傷の心からの高品質の画像が2日から6日に歳のゼブラフィッシュ胚のために多くの削減行列の時間内に得ることができます。我々の方法は、潜在的にゼブラフィッシュや他の小動物のいずれかから切除した他の器官を染色するために拡張することができます。

プロトコル

1。スライドの準備と加湿チャンバー

1. 加湿チャンバーを空にチップボックスのようなボックスから行うことができます。チャンバーと光から試料を保護するためにアルミホイルでカバーの両方を包みます。
2. チャンバー内に、乾燥から心臓サンプルを防ぐことがチャンバ内の湿度を維持するために湿紙タオルの山を置く。スライド用ラックとしてペーパータオルの上に小さなプレートを設定します。
3. 5 × 5 mm程度の寸法と心臓のサンプル用井戸を作るためにimmEdgeのペンを使って顕微鏡スライドの表面に線や円のいずれかを描く。スライドを乾燥させて。
4. 加湿チャンバー内のスライドを入れて、各ウェルに50UL新鮮な4％のホルムアルデヒドを追加。

2。胚の心臓の解剖

1. 魚止めのボディの動きまで、約1分間0.4％tricaineを含むE3卵の水⁷で魚の胚を麻酔がまだ正常な心を持っている鼓動。
2. 解剖顕微鏡のステージ上に凹の顕微鏡用スライドを置く。よく凹部に胚を移す。
3. 明らかに心を明らかにするために解剖顕微鏡の光の組み合わせを調整します。個人の好みに応じて、暗視野やDICのような偏光状態のいずれかである可能性があります。
4. その後、乾燥、75％エタノールで2つのインスリン注射器を清掃してください。
5. 心臓より高い倍率と焦点に解剖顕微....

ディスカッション

古典的な全体のマウント免疫染色の方法に比べ、本手法は次のような利点があります。最初に、はるかに強い蛍光シグナルが一貫して改善された浸透のために取得することができます。全体のマウント免疫染色法では、心臓を取り巻く濃い皮膚組織は大幅に全身に高グラウンドで、その結果、多くの抗体の浸透を減少させた。この問題は、3日後に受精（DPF）より古い胚には特に厳しいです。対照的に、解剖心ははるかに良い浸透をレンダリングする、いくつかの細胞層で構成されています。第二に、ために多くの改善浸透、免疫染色のプロセス全体は、1日からわずか数時間に短縮することができます。我々は成功し、1時間からこのようなアクチニンなどのいくつかの抗体のための30分にIntegin結合キナーゼ（ILK）、およびβ-カテニン特異的抗体をインキュベーション時間を短縮している。第三に、高解像度の画像は、一貫して無傷の心から得ることができます。セルラー/細胞内の情報を明らかにする。ため卵黄の横にある心膜嚢の内部心臓の局在から、より高い倍率の対物レンズは、画像はそのまま胚を使用することはできません。したがって、心はそのまま心の画像が必要な場合解剖する必要があります。しかし、このような胚を弱める.......

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
試薬の名前	会社	カタログ番号
tricaine	研究の有機物	3007T
ホルムアルデヒド	Polysciences	04018
インスリン注射器	ベクトンディッキンソン	329461
トリトンX - 100	シグマ	T8532
抗β-カテニン抗体	シグマ	C7207
抗MEF2C抗体	サンタクルスバイオテクノロジー	SC313
F59	ZFIN
抗α-アクチニン抗体	シグマ	A7811
抗ILK抗体	細胞シグナリング	＃3862
のAlexa Fluor ® 568ヤギ抗ウサギIgG抗体 TD>	インビトロジェン	A11011
のAlexa Fluor ® 488ヤギ抗マウスIgG1	インビトロジェン	A21121
蛍光用封入剤	ベクトル	H - 1200
ImmEdgeペン	ベクトル	H - 4000
ポリ- L -リシンコートしたスライド	電子顕微鏡学	63410〜01
顕微鏡のカバーガラス	フィッシャー	12から543 - D
凹んだ顕微鏡スライド	フィッシャー	7-1305-8
解剖顕微鏡	ライカMZ95
化合物の顕微鏡	ツァイス	Axioplan2
線分	ツァイス

PBST：
1 × PBS
0.5％トリトンX - 100

ENT"> 25X Tricaine：
400 mgのTricaine
97.9 mLののddH ₂ O
2.1 mLの（1MトリスPH9）
pHを7.0に調整する