Быстрый способ проведения иммунной из рыбок данио сердце эмбриональных описано. По сравнению с весь подход иммуноокрашивания гору, этот метод значительно увеличивает проникновение антител, что позволяет получать изображения с высоким разрешением, которые показывают сотовой / субклеточных структур в сердце в течение намного сократить время обработки.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Иммуноокрашивание расчлененного данио рерио Эмбриональные сердца
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Данио рерио эмбрион становится популярным в модельном позвоночных естественных условиях для изучения развития сердечных и человеческих пороков сердца благодаря своему выгодному эмбриологии и генетики 1,2. Около 100-200 эмбрионов легко доступны каждую неделю от одной пары взрослых рыб. Прозрачные эмбрионы, которые развивают бывшие внутриутробно делают их идеальными для оценки пороки сердца 3. Выражением какого-либо гена можно манипулировать с помощью морфолино технологии или РНК инъекций 4. Более того, вперед генетические экраны уже сформирован список мутантов, которые затрагивают различные перспективы cardiogenesis 5.
Всего иммуноокрашивания крепление важная техника в этой животной модели выявить экспрессии целевого белка в определенной ткани 6. Тем не менее, изображения с высоким разрешением, которые могут раскрыть клеточный или субклеточных структур, было трудно, в основном за счет физических нахоионного сердца и бедных проникновение антител.
Здесь мы представляем метод для решения этих узких мест, анализируя сердца, а затем проводят окрашивание процесс на поверхности стекло микроскопа. Для предотвращения потери небольших образцов сердце и облегчить решение обработки, мы ограничили сердце образцов в круг на поверхности предметные стекла, запряженной immEdge пера. После окрашивания, сигналов флуоресценции можно непосредственно наблюдать соединение микроскопа.
Наш новый метод значительно улучшает проникновение на наличие антител, так как сердце от эмбриональных рыбу только состоит из нескольких слоев клеток. Высокое качество изображения с нетронутыми сердца могут быть получены в значительно снижается процессия время для рыбок данио эмбрионов в возрасте от 2-й день за днем 6. Наш метод может быть потенциально распространяться на другие органы пятно расчлененный либо из рыбок данио или других мелких животных.
Протокол
1. Подготовка слайдов и влажной камере
- Влажной камере могут быть сделаны из окна, такие как опустели наконечник коробки. Оберните обе камеры и накрыть алюминиевой фольгой для защиты образцов от света месте.
- Внутри камеры, поставить кучу мокрой бумажные полотенца для поддержания влажности воздуха внутри камеры, что позволит предотвратить сердце образцы от высыхания. Установите небольшой планшет на вершине бумажное полотенце в качестве стойки для слайдов.
- Ничья либо линии или круги на поверхности стекло микроскопа использованием immEdge перо, чтобы сделать скважины для сердца образцы с диаметром около 5х5 мм. Пусть слайды сухой.
- ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
По сравнению с классическими методами иммунной целом горе, наш метод имеет следующие преимущества. Во-первых, гораздо сильнее, флуоресцентные сигналы могут быть последовательно получены благодаря улучшению проникновения. В целом метод иммунной горы, плотной ткани кожи вокруг сердца значительно уменьшается проникновение много антител, что приводит к высоким фоном во всем теле. Эта проблема особенно серьезна для эмбрионов старше 3-дневный после оплодотворения (DPF). В противоположность этому, расчлененный сердца состоять .......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Нет конфликта интересов объявлены.
Благодарности
Мы благодарим Beninio Jomok за помощь в данио хозяйства. Эта работа финансируется NIH HL81753.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Название реагента | Компания | Номер по каталогу | |
| tricaine | Исследование органических | 3007T | |
| Формальдегид | Polysciences | 04018 | |
| Инсулин шприц | Becton Dickinson | 329461 | |
| Тритон-Х-100 | Сигма | T8532 | |
| Anti-β-катенина антител | Сигма | C7207 | |
| Анти-Mef2c антител | Санта-Крус-Biotech | SC313 | |
| F59 | Zfin | ||
| Анти-α-актинина антител | Сигма | A7811 | |
| Анти-Ilk антител | Сотовые сигнализации | # 3862 | |
| Alexa Fluor 568 козьего анти IgG кролика TD> | Invitrogen | A11011 | |
| Alexa Fluor 488 козьего анти мыши IgG1 | Invitrogen | A21121 | |
| Монтаж средой для флуоресценции | Вектор | H-1200 | |
| ImmEdge пера | Вектор | H-4000 | |
| Poly-L-лизин покрытием слайды | Электронная микроскопия наук | 63410-01 | |
| Стекло микроскопа крышкой | Рыболов | 12-543-D | |
| Вогнутую слайды микроскопом | Рыболов | 7-1305-8 | |
| Препарирование микроскопом | Leica MZ95 | ||
| Соединения микроскопом | Zeiss | Axioplan2 | |
| ApoTome | Zeiss |
PBST:
1 х PBS
0,5% Triton-X 100
400 мг Tricaine
97,9 мл DDH 2 O
2,1 мл (1М Трис PH9)
Отрегулируйте рН до 7,0
Ссылки
- Shin, J. T., Fishman, M. C. From Zebrafish to human: modular medical models. Annu. Rev. Genomics Hum. Genet. 3, 311-340 (2002).
- Beis, D., Stainier, D. Y. In vivo cell biology: following the zebrafish trend. Trends. Cell. Biol. 16, 105-112 (2006).
- Schoe....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
