Vidhäftning Frekvens analys för In Situ Kinetik Analys av Cross-Junktional Molekylär växelverkan vid cell-cell Interface
Summary
En vidhäftning frekvens test för mätning av receptor-ligand interaktioner kinetik när båda molekyler är förankrade på ytan av de samverkande celler beskrivs. Denna mekaniskt baserad analys exemplifieras med hjälp av en mikropipett trycksatt människans röda blodkroppar som adhesion sensor och integrin αLβ2 och intercellulära adhesionsmolekyl-1 som interagerande receptorer och ligander.
Abstract
Den mikropipett vidhäftning test utvecklades 1998 för att mäta tvådimensionella (2D) receptor-ligand bindning kinetik 1. Analysen använder en mänsklig röda blodkroppar (RBC) som vidhäftning sensor och presentera cell för en av de samverkande molekyler. Den sysselsätter mikromanipulation att få RBC i kontakt med en annan cell som uttrycker det andra interagera molekyl med exakt kontrollerat område och tid att band bildas. Vidhäftningen händelsen detekteras som RBC töjning på att dra i två celler isär. Genom att kontrollera tätheten av ligander immobiliserade på RBC ytan, är sannolikheten för vidhäftning hålls i mitten av intervallet mellan 0 och 1. Vidhäftningen Sannolikheten beräknas från frekvensen vidhäftning händelser i en sekvens av upprepad kontakt cykler mellan två celler för en viss kontakttid. Varierande kontakttiden genererar ett bindande kurva. Montering av en probabilistisk modell för receptor-ligand reaktionskinetik 1 till bindandekurvan återgår 2D affinitet och off-takt.
Analysen har validerats med hjälp av interaktioner mellan Fcγ receptorer med IgG Fc 1-6, selectins med glycoconjugate ligander 6-9, integriner med ligander 10-13, homotypical cadherin bindande 14, T cells receptor och coreceptor med peptid-dur histocompatibility komplex 15 – 19.
Metoden har använts för att kvantifiera föreskrifter 2D kinetik av biofysiska faktorer, som membranet microtopology 5, membran ankare 2, molekylär inriktning och längd 6, bärare stelhet 9, krökning 20 och impingement kraft 20 samt biokemiska faktorer, som modulatorer av cytoskelettet och membran mikromiljö där interagerande molekyler vistas och ytan organisationen av dessa molekyler 15,17,19.
Metoden har också använts to studerar samtidigt bindning av dubbla receptor-ligand arter 3,4 och trimolecular interaktioner 19 med hjälp av en modifierad modell 21.
Den stora fördelen med metoden är att det tillåter studier av receptorer i sitt eget membran miljö. Resultaten kan vara mycket olika de som erhålls med renade receptorer 17. Det ger också studiet av receptor-ligand interaktioner i en sub-sekunders tid med tidsupplösning långt utanför den typiska biokemiska metoder.
För att illustrera mikropipett metoden vidhäftning frekvens visar vi kinetik mätning av intercellulär adhesionsmolekyl 1 (ICAM-1) functionalized på röda blodkroppar bindning till integrin α L β 2 på neutrofiler med dimeriskt E-selektin i lösningen för att aktivera α L β 2.
Protocol
Discussion
För att framgångsrikt använda mikropipett analysen vidhäftning frekvens man bör tänka på flera viktiga steg. Börja med att kontrollera att spela in den specifika interaktionen för receptor-ligand systemet av intresse. Ospecifik kontrollmätningar (jfr figur. 3, 4) se till att specificitet. Helst bör ospecifik vidhäftning sannolikheter ligga under 0,05 för samtliga löptider kontakttid och att ha en betydande skillnad mellan det specifika och ospecifika vidhäftning sannolikheter för varje tidpunkt. Olika me…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denna studie fick stöd av NIH bidrag R01HL091020, R01HL093723, R01AI077343 och R01GM096187.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue # | Comments |
|---|---|---|---|
| 10x PBS | BioWhittaker | 17-517Q |
Dilute to 1x with deionized water prior to use |
| Vacutainer EDTA | BD | 366643 | RBCs isolation |
| 10ML PK100 | |||
| Histopaque 1077 | Sigma-Aldrich | 10771 | RBCs isolation |
| Adenine | Sigma-Aldrich | A2786 | EAS-45 preparation |
| D-glucose (dextrose) | Sigma-Aldrich | G7528 | EAS-45 preparation |
| D-Mannitol | Sigma-Aldrich | 6360 | EAS-45 preparation |
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S7653 | EAS-45 preparation |
| Sodium Phosphate, Dibasic (Na₂HPO₄) | Fisher Scientific | S374 | EAS-45 preparation |
| L-glutamine | Sigma-Aldrich | G5763 | EAS-45 preparation |
| Biotin-X-NHS | Calbiochem | 203188 | RBCs biotinylation |
| Dimethylformamide (DMF) | Thermo Scientific | 20673 | RBCs biotinylation |
| Borate Buffer (0.1M) | Electron Microscopy Sciences | 11455-90 | RBCs biotinylation |
| Streptavidin | Thermo Scientific | 21125 | Ligand functionalizing |
| BSA | Sigma-Aldrich | A0336 | Ligand functionalizing |
| Quantibrite PE Beads | BD Biosciences | 340495 | Density quantification |
| Flow cytometer | BD Immunocytometry Systems | BD LSR II |
Density quantification |
Capillary Tube 0.7-1.0mm x 30" |
Kimble Glass Inc. | 46485-1 | Micropipette pulling |
| Mineral Oil | Fisher Scientific | BP2629-1 | Chamber assembly |
| Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 12-544-G | Chamber assembly |
PE α-human CD11a Clone HI 111 |
eBioscience | 12-0119-71 | Reagent for Fig.1 |
| PE anti-human CD54 | eBioscience | 12-0549 | Reagent for Fig.1 |
| Mouse IgG1 Isotype Control PE | eBioscience | 12-4714 | Reagent for Fig.1 |
| hydraulic micromanipulator | Narishige | MO-303 | Micropipette system |
| Mechanical manipulator | Newport | 461-xyz-m, SM-13, DM-13 | Micropipette system |
| piezoelectric translator | Physik Instrumente | P-840 | Micropipette system |
| LabVIEW | National Instruments | Version 8.6 | Micropipette system |
| DAQ board | National Instruments | USB-6008 | Micropipette system |
| Optical table | Kinetics Systems | 5200 Series | Micropipette system |
References
- Chesla, S. E., Selvaraj, P., Zhu, C. Measuring two-dimensional receptor-ligand binding kinetics by micropipette. Biophys. J. 75, 1553-1572 (1998).
- Chesla, S. E., Li, P., Nagarajan, S., Selvaraj, P., Zhu, C. The membrane anchor influences ligand binding two-dimensional kinetic rates and three-dimensional affinity of FcgammaRIII (CD16). J. Biol. Chem. 275, 10235-10246 (2000).
- Williams, T. E., Nagarajan, S., Selvaraj, P., Zhu, C. Concurrent and independent binding of Fcgamma receptors IIa and IIIb to surface-bound IgG. Biophys. J. 79, 1867-1875 (2000).
- Williams, T. E., Selvaraj, P., Zhu, C. Concurrent binding to multiple ligands: kinetic rates of CD16b for membrane-bound IgG1 and IgG2. Biophys. J. 79, 1858-1866 (2000).
- Williams, T. E., Nagarajan, S., Selvaraj, P., Zhu, C. Quantifying the impact of membrane microtopology on effective two-dimensional affinity. J. Biol. Chem. 276, 13283-13288 (2001).
- Huang, J. Quantifying the effects of molecular orientation and length on two-dimensional receptor-ligand binding kinetics. J. Biol. Chem. 279, 44915-44923 (2004).
- Long, M., Zhao, H., Huang, K. S., Zhu, C. Kinetic measurements of cell surface E-selectin/carbohydrate ligand interactions. Ann. Biomed. Eng. 29, 935-946 (2001).
- Chen, W., Evans, E. A., McEver, R. P., Zhu, C. Monitoring receptor-ligand interactions between surfaces by thermal fluctuations. Biophys. J. 94, 694-701 (2008).
- Wu, L. Impact of carrier stiffness and microtopology on two-dimensional kinetics of P-selectin and P-selectin glycoprotein ligand-1 (PSGL-1) interactions. J. Biol. Chem. 282, 9846-9854 (2007).
- Waugh, R. E., Lomakina, E. B. Active site formation, not bond kinetics, limits adhesion rate between human neutrophils and immobilized vascular cell adhesion molecule 1. Biophys. J. 96, 268-275 (2009).
- Zhang, F. Two-dimensional kinetics regulation of alphaLbeta2-ICAM-1 interaction by conformational changes of the alphaL-inserted domain. J. Biol. Chem. 280, 42207-42218 (2005).
- Lomakina, E. B., Waugh, R. E. Adhesion between human neutrophils and immobilized endothelial ligand vascular cell adhesion molecule 1: divalent ion effects. Biophys. J. 96, 276-284 (2009).
- Chen, W., Lou, J., Zhu, C. Forcing switch from short- to intermediate- and long-lived states of the alphaA domain generates LFA-1/ICAM-1 catch bonds. J. Biol. Chem. 285, 35967-35978 (2010).
- Chien, Y. H. Two stage cadherin kinetics require multiple extracellular domains but not the cytoplasmic region. J. Biol. Chem. 283, 1848-1856 (2008).
- Huang, J., Edwards, L. J., Evavold, B. D., Zhu, C. Kinetics of MHC-CD8 interaction at the T cell membrane. J. Immunol. 179, 7653-7662 (2007).
- Wasserman, H. A. MHC variant peptide-mediated anergy of encephalitogenic T cells requires SHP-1. J. Immunol. 181, 6843-6849 (2008).
- Huang, J. The kinetics of two-dimensional TCR and pMHC interactions determine T-cell responsiveness. Nature. 464, 932-936 .
- Sabatino, J. J., Huang, J., Zhu, C., Evavold, B. D. High prevalence of low affinity peptide-MHC II tetramer-negative effectors during polyclonal CD4+ T cell responses. J. Exp. Med. 208, 81-90 (2011).
- Jiang, N. Two-stage cooperative T cell receptor-peptide major histocompatibility complex-CD8 trimolecular interactions amplify antigen discrimination. Immunity. 34, 13-23 (2011).
- Spillmann, C. M., Lomakina, E., Waugh, R. E. Neutrophil adhesive contact dependence on impingement force. Biophys. J. 87, 4237-4245 (2004).
- Zhu, C., Williams, T. E. Modeling concurrent binding of multiple molecular species in cell adhesion. Biophys. J. 79, 1850-1857 (2000).
- Downey, G. P. Retention of leukocytes in capillaries: role of cell size and deformability. J. Appl. Physiol. 69, 1767-1778 (1990).
- Li, P. Affinity and kinetic analysis of Fcgamma receptor IIIa (CD16a) binding to IgG ligands. J. Biol. Chem. 282, 6210-6221 (2007).
- Chen, W., Zarnitsyna, V. I., Sarangapani, K. K., Huang, J., Zhu, C. Measuring Receptor-Ligand Binding Kinetics on Cell Surfaces: From Adhesion Frequency to Thermal Fluctuation Methods. Cell. Mol. Bioeng. 1, 276-288 (2008).
- Thoumine, O., Kocian, P., Kottelat, A., Meister, J. J. Short-term binding of fibroblasts to fibronectin: optical tweezers experiments and probabilistic analysis. Eur. Biophys. J. 29, 398-408 (2000).
- Ounkomol, C., Xie, H., Dayton, P. A., Heinrich, V. Versatile horizontal force probe for mechanical tests on pipette-held cells, particles, and membrane capsules. Biophys. J. 96, 1218-1231 (2009).
- Piper, J. W., Swerlick, R. A., Zhu, C. Determining force dependence of two-dimensional receptor-ligand binding affinity by centrifugation. Biophys. J. 74, 492-513 (1998).
- Li, P., Selvaraj, P., Zhu, C. Analysis of competition binding between soluble and membrane-bound ligands for cell surface receptors. Biophys. J. 77, 3394-3406 (1999).
- Long, M. Probabilistic modeling of rosette formation. Biophys. J. 91, 352-363 (2006).
- Lou, J. Flow-enhanced adhesion regulated by a selectin interdomain hinge. J. Cell. Biol. 174, 1107-1117 (2006).
- Yago, T., Zarnitsyna, V. I., Klopocki, A. G., McEver, R. P., Zhu, C. Transport governs flow-enhanced cell tethering through L-selectin at threshold shear. Biophys. J. 92, 330-342 (2007).
- Evans, E., Berk, D., Leung, A. Detachment of agglutinin-bonded red blood cells. I. Forces to rupture molecular-point attachments. Biophys. J. 59, 838-848 (1991).
- Zarnitsyna, V. I. Memory in receptor-ligand-mediated cell adhesion. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104, 18037-18042 (2007).
