가교 PEG의 히드로겔에서 세포의 사진 캡슐에 대한 방법을 설명합니다. 캡슐 murine insulinoma 이내 Hypoxic 신호 (MIN6) 집계는 형광 마커 시스템을 사용하여 추적할 수 있습니다. 이 시스템은 세포 표현형 변화 hypoxic 신호의 히드로겔 발판과 상관 내에서 세포의 직렬 시험을 수 있습니다.
당뇨병 제 1 형, 인슐린 생산의 손실과 잠재적으로 치명적인 고혈당증의 췌장 β – 세포 결과의 면역 파괴. 외인성 인슐린 주사에 대한 대안 치료 옵션으로, 기능성 췌장 조직의 이식은 1,2을 탐험했습니다. 이러한 접근 방식은 normoglycemia보다 자연, 장기 복원의 약속을 제공합니다. 숙주의 면역 시스템에서 기증자의 조직을 보호 거절과 캡슐이 목표를 달성하는 데 사용하는 방법입니다 방지하기 위해 필요합니다.
이러한 알지네이트요 3 아가로 오스 4와 같은 생물 학적 파생 자료, 캡슐 건설을위한 전통적인 선택을하고 있지만 염증이나 양분과 산소 운반을 방해 할 수 fibrotic 전면에 자라난 5 유발 수 있습니다. 또는, 합성 폴리 (에틸렌 글리콜) (PEG) 기반 hydrogels는 고순도에서 쉽게 작용 가능한 아닌 굴욕 아르제어 기공 크기를 가지고 있고, 매우 6,7,8, biocompatible 수 있습니다. 추가 혜택으로, PEG의 hydrogels가 아닌 생리적 온도 6,7의 신청서를 요구하지 않는 간단한 사진 crosslinking 반응에 빠르게 형성 수 있습니다. 이러한 절차는 여기에 설명되어 있습니다. crosslinking 반응, photoinitiator의 자외선 열화, 1 – [4 – (2 – Hydroxyethoxy) – 페닐]은 2 – 히드록시 -2 – 메틸 -1 – 프로판 -1 – 한 (Irgacure 2959)가, 자유 래디 칼의 생성 공격하는 사슬에서 dimethacrylated PEG (PEGDM) 유도 crosslinking의 비닐 탄소 – 탄소 이중 채권이 끝납니다. Crosslinking 10 분 이내에 얻을 수 있습니다. 이러한 방식으로 구축 PEG의 hydrogels은 호의 셀 7,9을 지원하는 그림, 그리고 낮은 photoinitiator 농도와 UV 조사에 짧은 노출은 캡슐 조직 10 가능성과 기능에 해로운 없습니다되었습니다. 방법과 우리의 PEG는 아래에 설명된 우리가 메타 크릴 레이트 동안 PEGDM는 방향 수 있습니다ectly 같은 시그마와 같은 업체에서 구입했습니다.
캡슐의 내재된 결과는 혈관 네트워크에서 세포의 격리입니다. 영양분의 공급, 특히 산소 따라서 감소 및 확산에 의해 제한됩니다. 이 감소 산소 가용성은 특히 인슐린 분비 그의 기능은 산소가 11-13에 크게 의존 β – 세포에 영향을 수 있습니다. 캡슐 구성과 기하학은 또한 산소 확산 속도와 길이에 영향을 것입니다. 따라서, 우리는 또한 PEG의 캡슐 안에 hypoxic 세포를 식별하는 기술을 설명합니다. 재조합 아데노 바이러스와 세포의 감염 세포 hypoxia – inducible 인자 (HIF) 경로 14을 활성화하는 경우 생산이 될 수있는 형광 신호 수 있습니다. HIFs은 hypoxia에 대한 transcriptional 응답의 주요 규제이므로, 그들은 hypoxic 신호 15 검출을위한 이상적인 대상 마커를 나타냅니다. 이러한 접근 방식은 hypoxi 쉽고 빠르게 감지를 허용C 세포. 간단히, 아데노 바이러스는 hypoxia – 반응 요소 (HRE) trimer의 통제하에 빨간 형광 단백질 (Clontech에서 DS 레드 DR)의 순서가 있습니다. 낮은 산소 조건에 의해 HIF – 1의 안정화는 형광 단백질 (그림 1)의 전사를 운전합니다. 이 바이러스의 건설에 대한 자세한 내용은 이전에 15 공개되었습니다. 바이러스는 -80에서 10 % 글리세롤에 저장됩니다 ° C 3.4 X 10 10 pfu / ML의 농도 1.5 ML의 원심 분리기 튜브의 많은 150 μL aliquots로.
우리가 실험실에서 이전 연구는 집계가 20 % 산소 문화의 사주를 통해 자신의 생존을 유지 등 MIN6 세포가 캡슐 것으로 나타났습니다. MIN6 2 교양 합산 또는 1 %의 산소가 ethidium의 브로마이드와 얼룩뿐만 아니라 20 %의 산소의 세포에 상대적인 형태학의 변화에 의한 괴사성 세포의 두 신호를 (여전히 85-90 % 정도 가능한)했다. 20 % 표시 집계의 부드러운 구형 모양이 로스되었습니다T와 합산보다 세포의 분열증 집단처럼 나타났다. 낮은 산소 스트레스 생존의 발음 드롭을 일으키지 않습니다 있지만, 그것은 분명 MIN6 집합과 포도당 자극 인슐린 분비 15 일까지 측정과 같은 기능을 영향을 미치는 것입니다. 20 % 캡슐 세포와 1 %의 산소 서양 얼룩 분석도 DsRed DR 단백질의 표현과 상호 낮은 산소 조건에서 배양해 세포에 대한 HIF – 1α의 상당한 증가를 보였다.
여기서 제시하는 방법이 아닌 생리적 조건의 최소한의 사용 PEG의 히드로겔의 세포 캡슐을위한 빠르고 간단한 방법을 제공합니다. PEG는 biocompatibility 및 수정의 용이성을 위해 매우 유용한 캡슐 소재를 나타냅니다. 광활성이있는 솔루션에 PEG 비율의 간단한 변화는, 예를 들어, 기공 크기를 통해 기계와 같은 압축 계수와 같은 속성, 그리고 교통 속성을 조정하는 데 사용할 수 있습니다. 또한 PEG 쉽게 사이드 체인의 추가에 의해 수정됩니다. PEG의 hydrogels 따라서 유망한 임상 장치와 체외 연구를위한 유연한 플랫폼을 모두 나타내는
PEG – 캡슐 세포에서 hypoxia를 추적하는 방법도 소개되었습니다. 이 방법은 hypoxia 감지의 단순과 관심의 세포를 희생 필요가 피하에 유용합니다. 이 기술은 그 회사를 만드는 조건을 다양한 세포 유형의 다양한 적용될 수 있습니다넓은 efulness. 예를 들어, 줄기 세포 차별 화를위한 신호로서 hypoxia는 줄기 세포 micromass 문화에서 추적할 수 있습니다. 그러나,이 방법은 세포가 나중에 집계됩니다 분산되는 전지 시스템 또는 시스템을 해산하기 위해 적용할 수 있습니다. 또한, 형광 신호의 감지가 크거나 밀도 조직에서 어려울 수 있습니다.
The authors have nothing to disclose.
넉넉한 MIN6 세포를 공급 콜로라도 대학 볼더의 크리스티 Anseth 연구소에 감사합니다. 이 프로젝트에 대한 자금은 NSF에 의해 제공되었습니다.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional |
PEG | Sigma-Aldrich | 309028-500G | |
Methacrylic Anhydride | Sigma-Aldrich | 276685-100ML | |
Microwave | Emerson | MW8784SB | |
Vortexer | Scientific Industries | SI-A236 | |
Methylene Chloride | Sigma-Aldrich | D65100-1L | |
Diethyl Ether | Sigma-Aldrich | 346136-1L | |
Dialysis Tubing | Spectrum | 132640 | |
Laboratories | |||
Freezer | |||
Lyophilizer | Labconco | 7670521 | |
Vacuum pump | Welch | 8917Z-01 | |
Irgacure 2959 | Ciba-Geigy | 029891301PS04 | |
HBSS | Mediatech | 21-022-CV | |
Syringe Filter | VWR | 28145-477 | |
RPMI 1640 | Mediatech | * | *custom formulation |
FBS | PAA Laboratories | A15-351 | |
Penicillin-Streptomycin | Mediatech | 30-002-CI | |
Amphotericin B | Mediatech | 30-003-CF | |
Incubator | Thermo Scientific | 3597 | Napco Series 8000 WJ w/ O2 suppression |
Trypsin EDTA | Mediatech | 25-052-CI | |
Orbital Shaker | VWR | 12620-926 | |
UV Lamp | Sanyo Denri | FLR40SBLB/M | Holds two 40W, 365nm blacklight blue UV bulbs |
Centrifuge | Eppendorf | 5811 000.010* | *order number. Model 5810 R |
Microscope | Nikon | TI-ND6-PFS | With filterset for 556nm excitation/ 586nm emission |