अलगाव और फलों cuticles की biophysical अध्ययन
Summary
हवाई संयंत्र अंगों छल्ली, supramolecular विधानसभा biopolyester मोम के द्वारा संरक्षित कर रहे हैं. हम वर्तमान प्रोटोकॉल के चुनिंदा हटाने महामारी और intracuticular waxes, टमाटर फल cuticles से आणविक और सूक्ष्म तराजू पर ठोस राज्य एनएमआर और परमाणु शक्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा, क्रमशः पर नजर रखने के लिए, और इंजीनियर चर्म संबंधी biopolyesters के पार से जोड़ने की क्षमता का आकलन.
Abstract
The cuticle, a hydrophobic protective layer on the aerial parts of terrestrial plants, functions as a versatile defensive barrier to various biotic and abiotic stresses and also regulates water flow from the external environment.1 A biopolyester (cutin) and long-chain fatty acids (waxes) form the principal structural framework of the cuticle; the functional integrity of the cuticular layer depends on the outer ‘epicuticular’ layer as well as the blend consisting of the cutin biopolymer and ‘intracuticular’ waxes.2 Herein, we describe a comprehensive protocol to extract waxes exhaustively from commercial tomato (Solanum lycopersicum) fruit cuticles or to remove epicuticular and intracuticular waxes sequentially and selectively from the cuticle composite. The method of Jetter and Schäffer (2001) was adapted for the stepwise extraction of epicuticular and intracuticular waxes from the fruit cuticle.3,4 To monitor the process of sequential wax removal, solid-state cross-polarization magic-angle-spinning (CPMAS) 13C NMR spectroscopy was used in parallel with atomic force microscopy (AFM), providing molecular-level structural profiles of the bulk materials complemented by information on the microscale topography and roughness of the cuticular surfaces. To evaluate the cross-linking capabilities of dewaxed cuticles from cultivated wild-type and single-gene mutant tomato fruits, MAS 13C NMR was used to compare the relative proportions of oxygenated aliphatic (CHO and CH2O) chemical moieties.
Exhaustive dewaxing by stepwise Soxhlet extraction with a panel of solvents of varying polarity provides an effective means to isolate wax moieties based on the hydrophobic characteristics of their aliphatic and aromatic constituents, while preserving the chemical structure of the cutin biopolyester. The mechanical extraction of epicuticular waxes and selective removal of intracuticular waxes, when monitored by complementary physical methodologies, provides an unprecedented means to investigate the cuticle assembly: this approach reveals the supramolecular organization and structural integration of various types of waxes, the architecture of the cutin-wax matrix, and the chemical composition of each constituent. In addition, solid-state 13C NMR reveals differences in the relative numbers of CHO and CH2O chemical moieties for wild-type and mutant red ripe tomato fruits. The NMR techniques offer exceptional tools to fingerprint the molecular structure of cuticular materials that are insoluble, amorphous, and chemically heterogeneous. As a noninvasive surface-selective imaging technique, AFM furnishes an effective and direct means to probe the structural organization of the cuticular assembly on the nm-μm length scale.
Protocol
Discussion
प्रोटोकॉल वर्णित यहाँ विनाशकारी रासायनिक टूटने के लिए जरूरत के बिना एक जटिल असभ्य संयंत्र सामग्री की विस्तृत आणविक और microscale लक्षण वर्णन के लिए अनुमति देते हैं. विभिन्न लिपिड (वैक्स) है कि चर्म संबंधी विधानसभा के संरचनात्मक संगठन, 10 हम किया और निगरानी की विषम चर्म संबंधी मिश्रण से epicuticular और intracuticular waxes की चयनात्मक हटाने के लिए प्रक्रियाओं पर नियंत्रण के साथ cutin biopolyester के सम्मिश्रण की जांच करने के लिए. ठोस राज्य 13 सी एनएमआर मोम आणविक घटकों की निकासी लाइन के लिए इस्तेमाल किया गया था, और परमाणु शक्ति माइक्रोस्कोपी सतह खुरदरापन में सहवर्ती बदलाव की जांच सेवा 6,11 खेती जंगली प्रकार के और एक जीन से पार से जोड़ने cutins की क्षमताओं की तुलना उत्परिवर्ती टमाटर फल, ठोस राज्य के 13 सी एनएमआर भी चो और दर्पण 2 हे रासायनिक moieties के रिश्तेदार की संख्या का अनुमान किया गया था.
डिजाइन सुविधा का एक संख्याइस प्रोटोकॉल के उल्लेखनीय हैं. मोम के रूप में सामग्री lipids की एक विस्तृत श्रृंखला शामिल, मुक़्तलिफ़ छोर वाले सॉल्वैंट्स की एक श्रृंखला के साथ फल छल्ली इलाज संपूर्ण डीवैक्सिंग को प्राप्त करने के लिए आवश्यक है. इसके अलावा, डीवैक्सिंग समय 8 घंटे से 24 घंटे छल्ली नमूनों की प्रकृति के आधार पर भिन्न हो सकते हैं. लगातार बरकरार फल छल्ली से epicuticular waxes निकालने, यह चिपकने वाली कोटिंग समान रूप से लागू करने के लिए सतह के लिए जरूरी है.
ठोस राज्य CPMAS 13 सी 12 एनएमआर अत्यधिक विषम है और अघुलनशील संयंत्र biopolymers के विभिन्न संरचनात्मक घटकों की पहचान करते हुए उनके मूल शारीरिक विशेषताओं के संरक्षण के लिए एक तेजी से गुणात्मक विधि है, 13 परंपरागत एनएमआर समाधान राज्य भी निकाले मोम मिश्रण विशेषताएँ इस्तेमाल किया जा सकता है. यदि कार्यात्मक समूहों का आकलन मात्रात्मक बरकरार संयंत्र पॉलिमर, 5 उच्च विश्वस्तता प्रत्यक्ष ध्रुवीकरण जादू कोण कताई (डी के लिए वांछित हैPMAS 13) सी 5,14 एनएमआर एक पूरक पद्धति के रूप में इस्तेमाल किया जाना चाहिए. कार्य समूहों की सटीक quantitation पुनरावृत्ति बार, उत्तेजना पल्स लंबाई, और heteronuclear decoupling की ताकत से सावधान अनुकूलन की आवश्यकता है 15 heteronuclear decoupling 16 TPPM या का उपयोग करके 1 एच क्षेत्र 50 kHz से 185 kHz करने के लिए लेकर ताकत के लिए सेट किया जा सकता है. रीढ़ की हड्डी के तरीके 7. इन मापदंडों के अलावा, CPMAS माप की संवेदनशीलता स्पिन ताला समय और हार्टमैन – हैन मिलान शर्त पर निर्भर करता है 15 पारंपरिक CPMAS की जगह, एक ramped आयाम सी.पी. तकनीक (रैंप सीपी) को पार करने को अधिकतम करने के लिए लागू किया जा सकता है ध्रुवीकरण 1 एच आयाम रैखिक अलग (~ 20-50%) या tangentially जबकि 13 सी क्षेत्र स्पिन लॉक अवधि (या विपरीत) के दौरान निरंतर शक्ति के आयाम रखने के द्वारा दक्षता 17,18 बाहर ले जाने पर CPMAS माप. दो अलग अलग भूमिका की एक न्यूनतमटो – कताई आवृत्तियों मुख्य वर्णक्रमीय चोटियों से कताई sidebands भेद करने के लिए जरूरी है.
समवर्ती AFM संपर्क मोड में आयोजित मापन उच्च गति स्कैनिंग और उच्च संकल्प, मोमी घटकों में से एक अनुक्रमिक हटाने के दौरान 19 उदाहरण के लिए साथ छल्ली सतह के हालत के प्रत्यक्ष इमेजिंग सक्षम. दोहन में AFM या तो मामले में मोड (गैर संपर्क) नाजुक "सॉफ्ट" संयंत्र सामग्री की सतह लक्षण वर्णन के लिए एक विकल्प के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है, संभव पार्श्व बलों (कतरनी) की वजह से नुकसान से बचने और नमूना की सतह की scraping के 5,20. आपरेटिंग अनुक्रमिक सतह पर एक ही स्थान के एकाधिक छवियों के अधिग्रहण के लिए किसी भी सतह AFM माप में जांच सतह बातचीत के कारण क्षति की पहचान इष्टतम reproducibility के लिए कार्य करता है. 6,21 वसंत नरम उच्चर्म संबंधी सतहों के लिए उपयुक्त स्थिरांक के साथ AFM जांच होना चाहिए इस्तेमाल किया, तापमान और आर्द्रता की भक्ति और बनाए रखा जाना चाहिए 6,15,20 </sजबकि ठोस राज्य एनएमआर> कलाकारों की टुकड़ी (थोक) औसत टमाटर फल cuticles में गुणों का एक आणविक प्रोफ़ाइल प्रदान करता है, परमाणु शक्ति इमेजिंग इन exquisitely जटिल macromolecular विधानसभाओं की सतह स्थलाकृति पर नज़र रखने के लिए एक पूरक noninvasive 22,23 जांच प्रदान करता है 1,2.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम अमेरिका के राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन # MCB-0741914 और MCB 0843627 अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था, अतिरिक्त ढांचागत समर्थन 2 स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान अनुसंधान संसाधन के लिए राष्ट्रीय केन्द्र से G12 RR03060-26 द्वारा न्यूयॉर्क के सिटी कॉलेज में प्रदान किया गया. हम कृतज्ञता से स्वीकार करते हैं JKC M82 (जंगली प्रकार) और CM15 (उत्परिवर्ती) टमाटर cuticles प्रदान करने के लिए कार्नेल विश्वविद्यालय प्लांट बायोलॉजी विभाग में समूह गुलाब. हम उसके AFM प्रयोगों के साथ उदार मदद के लिए CCNY रासायनिक प्रो अलेक्जेंडर Couzis के इंजीनियरिंग समूह से डा. Spyros Monastiriotis धन्यवाद. हम ग्राफिक डिजाइन समर्थन के लिए धन्यवाद सुश्री लॉरेन Gohara.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalog no. | Comments |
| Sodium acetate trihydrate | Sigma-Aldrich | S8625-500G | |
| Pectinase | TCI America | P0026 | EC 3.2.1.15; 10 U ml-1, store in refrigerator |
| Cellulase | Sigma-Aldrich | C1184-100KU | EC232.734.4; 1.3 units/mg, store in refrigerator |
| Glacial Acetic acid | Sigma-Aldrich | A9967 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002-100G | Extremely hazardous |
| Incubator/shaker | New Brunswick Scientific Co. | Model No.G24 | MFG No.M1036-000G |
| Vacuum Oven | Precision Scientific | 31566 | |
| Variac Controller | |||
| Sintered glass thimble (85 mm/25mm) | VWR | 89056 | |
| Disposable extraction thimble ( 80 mm/ 25 mm) | VWR | 28320 | |
| Methanol | VWR | EMD-MX0485-7 | |
| Glass wool | VWR | RK20789 | |
| Aluminum foil | Fisher | 01-213-100 | |
| Tweezers | VWR | 82027-452 | |
| Chloroform | VWR | EM-CX1050-1 | |
| Hexane | Fisher Scientific | H302-4 | |
| Nitrogen gas | |||
| Parafilm | VWR | 52858 | |
| Paper towels | VWR | 89002-984 | |
| Kim wipes | VWR | 21905-026 | |
| Gum arabic | Sigma | G9752 | |
| 1.6 mm fastMAS zirconia rotor | Varian (Agilent) | ||
| NMR spectrometer | Varian 600 NMRS | standard bore magnet | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | 50046 | Model compound for CPMAS |
| Glutamine | Sigma-Aldrich | 49419 | Model compound for CPMAS |
| Adamantane | Sigma-Aldrich | 100277 | To calibrate 90° pulse in NMR |
| Multimode Scanning Probe Microscope (Nanoscope IIIA) | Digital Instruments (Bruker AXS) | ||
| Nanoscope software | Digital Instruments (Bruker AXS) | Version 5.30r3sr3 (2005) | |
| AFM probe (Nonconductive silicon nitride tip) | Veeco (Bruker AXS) | Model NP-20 | |
| Light microscope | Digital Instruments | ||
| Magnetic puck | Digital Instruments | ||
| Double sided tape | VWR | ||
| Fruit Peeler | |||
| Büchner funnel | VWR | 89038 |
References
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