Aerial plante organer er beskyttet av skjellaget, en supramolecular biopolyester-voks montering. Vi presenterer protokoller for å overvåke selektiv fjerning av epi-og intracuticular voks fra tomat frukt neglebånd på molekylære og mikro skalaer med solid-state NMR og atomic force mikroskopi, henholdsvis, og å vurdere kryssbinding kapasitet av konstruerte cuticular biopolyesters.
Skjellaget, en hydrofob beskyttende lag på luftig deler av landplanter, fungerer som en allsidig defensiv barriere til ulike biotiske og abiotiske stressfaktorer og regulerer også vannføringen fra det ytre miljø. 1 A biopolyester (cutin) og langkjedede fettsyrer ( voks) danner den viktigste strukturelle rammen av skjellaget, den funksjonelle integritet cuticular lag avhenger av ytre 'epicuticular' lag samt blanding bestående av cutin Biopolymer og 'intracuticular' Choice voks to her, beskriver vi en omfattende protokoll. å trekke voks uttømmende fra kommersiell tomat (Solanum lycopersicum) frukt neglebånd eller fjerne epicuticular og intracuticular voks sekvensielt og selektivt fra cuticle kompositt. Metoden for Jetter og Schäffer (2001) ble tilrettelagt for trinnvis uttak av epicuticular og intracuticular voks fra frukten neglebåndet. 3,4 å overvåkeProsessen med sekvensiell voks fjerning, solid-state cross-polarisering magic-angle-spinning (CPMAS) 13 C NMR spektroskopi ble brukt parallelt med atom kraft mikroskopi (AFM), som gir molekylære nivå strukturelle profiler av bulk materialer supplert med informasjon om mikroskala topografi og ruhet av cuticular overflater. Å vurdere tverrbindinger egenskapene avvoksede neglebåndene fra dyrket villtype og single-genet mutante tomat frukt, ble MAS 13 C NMR brukt for å sammenlikne de relative andeler av oksygenrikt alifatisk (CHO og CH 2 O) kjemiske moieties.
Uttømmende dewaxing ved trinnvis Soxhlet ekstraksjon med et panel av løsemidler med varierende polaritet gir et effektivt middel for å isolere voks moieties basert på hydrofobe egenskapene deres alifatiske og aromatiske bestanddeler, og samtidig bevare den kjemiske strukturen i cutin biopolyester. Den mekaniske utvinning av epicuticular voks og Selective fjerning av intracuticular voks, da overvåket av komplementære fysiske metoder, gir en enestående mulighet til å undersøke cuticle montering: denne tilnærmingen avslører supramolecular organisasjon og strukturell integrasjon av ulike typer voks, arkitekturen av cutin-voks matrise, og den kjemiske sammensetningen av hver bestanddel. I tillegg avslører solid-state 13 C NMR forskjeller i de relative antallet CHO og CH 2 O kjemiske moieties for villtype og mutant røde modne tomater frukt. NMR teknikker tilby eksepsjonelle verktøy for å fingeravtrykk den molekylære strukturen av cuticular materialer som er uløselige, amorfe, og kjemisk uensartet. Som en ikke-invasiv overflate-selektiv avbildningsteknikk, møblerer AFM et effektivt og direkte måte å undersøke den strukturelle organiseringen av cuticular forsamlingen på nm-mikrometer lengde skala.
Protokollene beskrevet tillate for detaljert molekylær og mikroskala karakterisering av en kompleks intraktabel plantemateriale uten behov for destruktive kjemisk nedbrytning. For å undersøke blandingen av cutin biopolyester med ulike lipider (voks) som styrer den strukturelle organiseringen av cuticular forsamlingen, 10 vi gjennomførte og overvåket prosedyrer for selektiv fjerning av epicuticular og intracuticular voks fra heterogene cuticular blanding. Solid-state 13 C NMR ble brukt til å måle utvinning av voks molekylære komponenter, og atomic force mikroskopi servert å undersøke samtidige endringer i overflateruhet. 6,11 For å sammenligne tverrbindinger egenskapene cutins fra dyrket vill-type og single-genet mutante tomat frukt, ble solid-state 13 C NMR også brukt til å estimere de relative tall av Cho og CH 2 O kjemiske moieties.
En rekke designelements av denne protokollen, er bemerkelsesverdig. Som voksen materialene omfatter et bredt spekter av lipider, behandle frukt cuticle med en rekke løsemidler har avvikende polariteter er avgjørende for å oppnå uttømmende dewaxing. I tillegg kan avvoksing tid variere fra 8 timer til 24 timer avhengig av innholdet av de cuticle prøvene. Hvis du vil trekke epicuticular voks konsekvent fra intakt frukt skjellaget, er det viktig å påføre limet belegget jevnt til overflaten.
Solid-state CPMAS 13 C NMR 12 er en rask kvalitativ metode for å identifisere ulike strukturelle komponenter i svært heterogene og uløselig plante biopolymerer og samtidig bevare sitt opprinnelige fysiske egenskaper; 13 tradisjonelle løsningen state NMR kan også brukes til å karakterisere de utpakkede voks blandinger. Hvis kvantitativ estimering av funksjonelle grupper er ønskelig for de intakte anlegget polymerer, 5 hifi-direkte-polarisering magic-vinkel spinnende (DPMAS) 13 C NMR 5,14 bør brukes som en komplementær metode. Nøyaktig kvantifisering av de funksjonelle gruppene krever nøye optimalisering av resirkulerer ganger, eksitasjon puls lengder, og styrken av heteronuclear frikopling. 15. heteronuclear frikopling kan stilles for en 1 H feltstyrke spenner fra 50 kHz til 185 kHz ved hjelp av TPPM 16 eller Spinal 7 metoder. I tillegg til disse parametrene, avhenger sensitiviteten CPMAS målinger på spin-lock tid og Hartmann-Hahn matchende tilstand. 15. I stedet for tradisjonelle CPMAS, kan en trappet-amplitude CP (RAMP-CP) teknikken bli iverksatt for å maksimere korset -polarisering effektivitet ved å variere en H amplitude lineært (~ 20-50%) eller tangentially samtidig amplituden til 13 C feltstyrken konstant i spin-lås periode (eller vice versa). 17,18 Gjennomføring av CPMAS målinger på minimum to ulike rotor-spinnende frekvenser er viktig å skille spinnende sidebands fra de største spektrale topper.
Samtidige AFM målinger utført i kontakt modus muliggjøre direkte avbildning av skjellaget overflaten tilstand med høye scanning hastigheter og høy oppløsning, 19 for eksempel under sekvensiell fjerning av voksaktig bestanddeler. Driftsresultat AFM i tappe (ikke-kontakt) modusen kan brukes som et alternativ for flate karakterisering av delikate "myke" plantematerialer, unngå mulig skade på grunn av sideveis (skjær) styrker og skraping av prøven overflaten. 5,20 I begge tilfeller , sekvensiell kjøp av flere bilder av samme sted på overflaten tjener til å identifisere eventuelle skade overflaten på grunn av "probe-overflate interaksjoner" i AFM målinger. 6,21 For optimal reproduserbarhet, bør AFM sonder med vårens konstanter egnet for myke cuticular overflater være brukt, og konstant temperatur og fuktighet bør opprettholdes. 6,15,20 </sopp> Mens solid-state NMR gir en molekylær profil av ensemblet gjennomsnitt (bulk) eiendommer i tomat frukt neglebåndene, gir atomic force bildebehandling en komplementær invasiv probe 22,23 for sporing overflatetopografi av disse utsøkt komplekse makromolekylær forsamlinger. 1,2
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av US National Science Foundation tilskudd # MCB-0741914 og MCB-0843627, ytterligere infrastruktur til støtte ble gitt på The City College of New York ved National Institutes of Health 2 G12 RR03060-26 fra National Center for Research Resources. Vi takke for den JKC Rose gruppen i Cornell University Plant Biology Department for å gi M82 (villtype) og CM15 (mutant) tomat neglebåndene. Vi takker Dr. Spyros Monastiriotis fra CCNY Chemical Engineering gruppen av professor Alexander Couzis for hans sjenerøse hjelp med AFM eksperimenter. Vi takker Ms Lauren Gohara for grafisk design støtte.
Name of the reagent | Company | Catalog no. | Comments |
Sodium acetate trihydrate | Sigma-Aldrich | S8625-500G | |
Pectinase | TCI America | P0026 | EC 3.2.1.15; 10 U ml-1, store in refrigerator |
Cellulase | Sigma-Aldrich | C1184-100KU | EC232.734.4; 1.3 units/mg, store in refrigerator |
Glacial Acetic acid | Sigma-Aldrich | A9967 | |
Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002-100G | Extremely hazardous |
Incubator/shaker | New Brunswick Scientific Co. | Model No.G24 | MFG No.M1036-000G |
Vacuum Oven | Precision Scientific | 31566 | |
Variac Controller | |||
Sintered glass thimble (85 mm/25mm) | VWR | 89056 | |
Disposable extraction thimble ( 80 mm/ 25 mm) | VWR | 28320 | |
Methanol | VWR | EMD-MX0485-7 | |
Glass wool | VWR | RK20789 | |
Aluminum foil | Fisher | 01-213-100 | |
Tweezers | VWR | 82027-452 | |
Chloroform | VWR | EM-CX1050-1 | |
Hexane | Fisher Scientific | H302-4 | |
Nitrogen gas | |||
Parafilm | VWR | 52858 | |
Paper towels | VWR | 89002-984 | |
Kim wipes | VWR | 21905-026 | |
Gum arabic | Sigma | G9752 | |
1.6 mm fastMAS zirconia rotor | Varian (Agilent) | ||
NMR spectrometer | Varian 600 NMRS | standard bore magnet | |
Glycine | Sigma-Aldrich | 50046 | Model compound for CPMAS |
Glutamine | Sigma-Aldrich | 49419 | Model compound for CPMAS |
Adamantane | Sigma-Aldrich | 100277 | To calibrate 90° pulse in NMR |
Multimode Scanning Probe Microscope (Nanoscope IIIA) | Digital Instruments (Bruker AXS) | ||
Nanoscope software | Digital Instruments (Bruker AXS) | Version 5.30r3sr3 (2005) | |
AFM probe (Nonconductive silicon nitride tip) | Veeco (Bruker AXS) | Model NP-20 | |
Light microscope | Digital Instruments | ||
Magnetic puck | Digital Instruments | ||
Double sided tape | VWR | ||
Fruit Peeler | |||
Büchner funnel | VWR | 89038 |