Antenn växtorgan skyddas av ytterhuden, en supramolekylär biopolyester-vax montering. Vi presenterar protokoll för att övervaka selektivt borttagande av EPI-och intracuticular vaxer från nagelbanden tomatfrukt på molekylära och mikronivå med solid-state NMR och atomkraftsmikroskopi respektive och bedöma tvärbindning förmåga konstruerade cuticular biopolyesters.
Nagelband, ett hydrofobt skyddande skikt på flygbilder delarna av landväxter, fungerar som en mångsidig defensiv hinder för olika biotiska och abiotiska stress och reglerar även vattenflöde från den yttre miljön. 1 A biopolyester (inkoppling) och långkedjiga fettsyror ( vax) bildar den huvudsakliga strukturella ramen för nagelband, den funktionella integriteten hos cuticular skiktet beror på den yttre 'epicuticular' skiktet samt den blandning som består av kutin biopolymeren och 'intracuticular kallad konventionen vaxer 2 Häri beskriver vi en omfattande protokoll. att extrahera vaxer uttömmande från kommersiell tomat (Solanum lycopersicum) frukt nagelbanden eller ta bort epicuticular och intracuticular vaxer sekventiellt och selektivt från nagelbanden komposit. Metoden för Jetter och Schaffer (2001) var anpassad för en stegvis utvinning av epicuticular och intracuticular vaxer från frukten nagelband. Att övervaka 3,4Processen av stegvis vax avlägsnande, i fast tillstånd korspolarisation magic-angle spinning (CPMAS) 13 C NMR-spektroskopi användes parallellt med atomkraftmikroskopi (AFM), vilket ger molekylär nivå profiler av bulkmaterial kompletteras med information om mikroskala topografi och grovhet av cuticular ytor. För att utvärdera de tvärbindande förmåga awaxade nagelband från odlade vildtyp och enkel-genen mutanta tomat frukter, var MAS 13 ^ C NMR användes för att jämföra de relativa proportionerna av syresatt alifatiska (CHO och CH2O) kemiska delar.
Uttömmande awaxning genom stegvis Soxhlet extraktion med en panel av lösningsmedel med varierande polaritet ger ett effektivt sätt att isolera vax delar baserade på hydrofoba egenskaperna hos deras alifatiska och aromatiska beståndsdelar, samtidigt som den kemiska strukturen hos inkoppling biopolyester. Den mekaniska extraktion av epicuticular vaxer och Selective bort intracuticular vaxer, då övervakas av kompletterande fysiska metoder, ger en oöverträffad möjlighet att undersöka på nagelbanden församlingen: detta synsätt visar supramolekylär organisation och strukturell integrering av olika typer av vaxer, arkitekturen av inkoppling-vaxmatrisen, och den kemiska Sammansättningen av varje beståndsdel. Dessutom avslöjar fast tillstånd 13 '^ C NMR skillnader i de relativa antalen CHO och CH2O kemiska delar för vildtyp och mutant röda mogna tomater frukter. De NMR-tekniker erbjuder särskilda verktyg för att fingeravtrycket den molekylära strukturen hos cuticular material som är olösliga, amorf, och kemiskt heterogen. Som en icke-invasiv yt-selektiva bildteknik, förser AFM ett effektivt och direkt sätt att sondera den strukturella organisation cuticular församlingen om NM-um längdskala.
De protokoll som beskrivs häri möjliggör detaljerad molekylär och mikroskala karakterisering av en komplex svårbehandlad växtmaterial utan behov av destruktiv kemisk nedbrytning. För att undersöka blandningen av inkoppling biopolyester med olika lipider (vaxer) som styr den strukturella organisation cuticular församling, 10 genomförde vi och övervakas förfaranden för selektiv borttagning av epicuticular och intracuticular vaxer från heterogena cuticular blandningen. Solid-state C-13 NMR användes för att mäta extraktion av vax molekylära komponenter och atomkraftsmikroskopi tjänade till att undersöka samtidiga förändringar i ytråhet. 6,11 För att jämföra de tvärbindande förmåga cutins från odlade vildtyp och enkel-genen mutanta tomat frukter, var fast tillstånd 13 '^ C NMR också användas för att uppskatta det relativa antalet CHO och CH2O kemiska delar.
Ett antal av design-funktionens av detta protokoll är anmärkningsvärda. Som vaxmaterial omfattar ett brett spektrum av lipider, behandla frukten nagelband med en serie av lösningsmedel som har skilda polaritet är viktigt att uppnå fullständig avvaxning. Dessutom kan awaxning tid variera från 8 timmar till 24 timmar beroende på egenskaperna hos hinnan prover. För att extrahera epicuticular vaxer konsekvent från den intakta frukten nagelband, är det nödvändigt att applicera limmet beläggningen jämnt på ytan.
Solid-state CPMAS 13 C-NMR 12 är en snabb kvalitativ metod för identifiering av olika strukturella komponenter av mycket heterogena och olösliga vegetabiliska biopolymerer samtidigt deras ursprungliga fysikaliska egenskaper, 13 traditionell lösning-state NMR kan också användas för att karaktärisera de extraherade vax blandningar. Om kvantitativ uppskattning av funktionella grupper önskas för intakta växt polymerer, 5 avancerat hifi-ljud direkt polarisering Magic-vinkel spinning (DPMAs) 13 C-NMR 5,14 bör användas som en kompletterande metod. Exakt kvantifiering av de funktionella grupperna kräver en noggrann optimering av återanvänd gånger, excitation längder puls, och styrkan i heteronukleär frikoppling 15. Den heteronukleär frikoppling kan ställas in för en 1 H fältstyrka som sträcker sig från 50 kHz till 185 kHz med hjälp av TPPM 16 eller Spinal 7 metoder. Utöver dessa parametrar beror känslighet CPMAS mätningar på spin-lock tid och Hartmann-Hahn matchande tillstånd. 15 I stället för traditionella CPMAS kan en sluttande amplitud CP (RAMP-CP) teknik implementeras för att maximera korset -polarisering effektivitet genom att variera 1 H amplituden linjärt (~ 20-50%) eller tangentiellt medan amplituden på 13 C fältstyrka konstant under spin-lock period (eller vice versa). 17,18 Genomförande av CPMAS mätningarna vid minst två olika rotor-spinning frekvenser är viktigt att skilja spinning sidband från de största spektrala toppar.
Samtidiga AFM mätningar utförda i kontakt läget möjliggör direkt avbildning av nagelband yttillståndet med höga skanning hastigheter och hög upplösning, 19 till exempel vid sekventiell borttagning av vaxartade beståndsdelar. Rörelseresultatet AFM gäller att utnyttja (icke-kontakt)-läget kan användas som ett alternativ för utanpåliggande karakterisering av känsliga "mjuka" växtmaterial, undvika eventuella skador på grund av laterala (skjuvning) krafter och skrapning av provets yta. 5,20 I båda fallen , sekventiell förvärv av flera bilder av samma plats på ytan tjänar till att identifiera eventuella skador på ytan på grund av "sond-ytinteraktioner" i AFM mätningarna. 6,21 För optimal reproducerbarhet bör AFM sonder med fjäderkonstanter lämpliga för mjuka cuticular ytorna vara används och beständigheten i temperatur och luftfuktighet bör bibehållas. 6,15,20 </sup> Det solid-state NMR erbjuder en molekylär profil ensemble genomsnitt (bulk) fastigheter i nagelbanden tomat frukt ger Atomic Force avbildning en kompletterande icke-invasiv sond 22,23 för att spåra ytan topografi dessa utsökt komplexa makromolekylära församlingar. 1,2
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av amerikanska National Science Foundation # MCB-0741914 och MCB-0843627, ytterligare infrastrukturellt stöd gavs på City College of New York av National Institutes of Health 2 G12 RR03060-26 från National Center for Research Resources. Vi erkänner tacksamt att JKC Rose gruppen i Cornell University växtbiologi Institutionen för tillhandahållande av M82 (vild typ) och CM15 (mutant) tomat nagelband. Vi tackar Dr Spyros Monastiriotis från CCNY kemiteknik grupp Prof. Alexander Couzis för hans generösa hjälp med AFM experimenten. Vi tackar Ms Lauren Gohara för grafisk formgivning stöd.
Name of the reagent | Company | Catalog no. | Comments |
Sodium acetate trihydrate | Sigma-Aldrich | S8625-500G | |
Pectinase | TCI America | P0026 | EC 3.2.1.15; 10 U ml-1, store in refrigerator |
Cellulase | Sigma-Aldrich | C1184-100KU | EC232.734.4; 1.3 units/mg, store in refrigerator |
Glacial Acetic acid | Sigma-Aldrich | A9967 | |
Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002-100G | Extremely hazardous |
Incubator/shaker | New Brunswick Scientific Co. | Model No.G24 | MFG No.M1036-000G |
Vacuum Oven | Precision Scientific | 31566 | |
Variac Controller | |||
Sintered glass thimble (85 mm/25mm) | VWR | 89056 | |
Disposable extraction thimble ( 80 mm/ 25 mm) | VWR | 28320 | |
Methanol | VWR | EMD-MX0485-7 | |
Glass wool | VWR | RK20789 | |
Aluminum foil | Fisher | 01-213-100 | |
Tweezers | VWR | 82027-452 | |
Chloroform | VWR | EM-CX1050-1 | |
Hexane | Fisher Scientific | H302-4 | |
Nitrogen gas | |||
Parafilm | VWR | 52858 | |
Paper towels | VWR | 89002-984 | |
Kim wipes | VWR | 21905-026 | |
Gum arabic | Sigma | G9752 | |
1.6 mm fastMAS zirconia rotor | Varian (Agilent) | ||
NMR spectrometer | Varian 600 NMRS | standard bore magnet | |
Glycine | Sigma-Aldrich | 50046 | Model compound for CPMAS |
Glutamine | Sigma-Aldrich | 49419 | Model compound for CPMAS |
Adamantane | Sigma-Aldrich | 100277 | To calibrate 90° pulse in NMR |
Multimode Scanning Probe Microscope (Nanoscope IIIA) | Digital Instruments (Bruker AXS) | ||
Nanoscope software | Digital Instruments (Bruker AXS) | Version 5.30r3sr3 (2005) | |
AFM probe (Nonconductive silicon nitride tip) | Veeco (Bruker AXS) | Model NP-20 | |
Light microscope | Digital Instruments | ||
Magnetic puck | Digital Instruments | ||
Double sided tape | VWR | ||
Fruit Peeler | |||
Büchner funnel | VWR | 89038 |