حفز النمو في الخلايا العصبية شجيري متعاطف مثقف
Summary
وصفنا على بروتوكول لاستخدام البروتين مخلق العظام-7 (BMP-7) أو Matrigel للحث على انتقائية نمو الخلايا العصبية الجذعية في متعاطف الابتدائية فصلها عن العقد في عنق الرحم متفوقة (SCG) من الفئران قبل الولادة.
Abstract
شكل شجرة شجيري يحدد مساهمة مجموع متشابك إحدى الخلايا العصبية يمكن أن تحصل 1-3، ويؤثر على أنواع وتوزيع هذه المدخلات و 4-6. وترتبط أنماط المتغيرة للنمو الشجيرية واللدونة وظيفة السلوك العصبي مع ضعف في نماذج تجريبية 7، ويعتقد أنها تساهم في الأعراض السريرية التي لوحظت في كل من اضطرابات النمو العصبي 8-10 وأمراض الاعصاب 11-13. هذه الملاحظات تؤكد أهمية الوظيفية للتنظيم على وجه التحديد مورفولوجيا شجيري، وتشير إلى أن تحديد الآليات التي تتحكم في نمو شجيري لن تقدم فقط فهم كيفية اتصال الخلايا العصبية وينظم خلال التطور الطبيعي، ولكن يمكن أيضا أن تقدم فكرة عن الاستراتيجيات العلاجية رواية عن الأمراض العصبية المختلفة.
وسيتم دراسات الميكانيكية للنمو شجيري سهل إلى حد كبير من قبل س توفراتحاد كرة القدم النظام النموذجي الذي يسمح الخلايا العصبية تحول تجريبيا من الدولة التي لا تمتد إلى واحد في التشعبات التي وضع شجرة شجيري مماثلة لنظيراتها في الجسم الحي. الثقافات الأولية من الخلايا العصبية متعاطف فصلها عن العقد في عنق الرحم متفوقة (SCG) من القوارض فترة ما حول الولادة تقديم مثل هذا النموذج. عندما زرعها في وسط المحددة في حالة عدم وجود الخلايا الدبقية المصل والعقدية، الخلايا العصبية متعاطف توسيع نطاق عملية واحدة التي هي محور عصبي، وهذه حالة القطب الواحد يستمر لأسابيع أو أشهر في ثقافة 14،15. ومع ذلك، فإن إضافة أي التخلق عظم بروتين-7 (BMP-7) 16،17 أو Matrigel 18 إلى ثقافة المتوسط يطلق هذه الخلايا العصبية لتوسيع عمليات متعددة تلبي المورفولوجي، ومعايير الكيمياء الحيوية والوظيفية للالتشعبات. الخلايا العصبية متعاطف فصلها عن SCG من القوارض فترة ما حول الولادة، وتنمو في ظل ظروف محددة ويبلغ عدد سكانها متجانسة من الخلايا العصبية 19التي تستجيب بشكل موحد على النشاط التغصنات المعززة للمن Matrigel، BMP-7 وغيرها من أفضل الممارسات الإدارية decapentaplegic (النيابة العامة) و 60A تحت العوائل 17،18،20،21. الأهم من ذلك، Matrigel وBMP التي يسببها التغصنات تشكيل يحدث في حالة عدم وجود تغييرات في بقاء الخلية أو نمو محواري 17،18.
هنا، نحن تصف كيفية إعداد الثقافات فصلها من الخلايا العصبية متعاطف المستمدة من SCG من الفئران قبل الولادة، بحيث تستجيب لنشاط التغصنات المعززة للانتقائية من Matrigel أو أفضل الممارسات الإدارية.
Protocol
Discussion
من مزايا هذا النموذج ما يلي: (أ) وتتألف من ثقافات السكان متجانسة من الخلايا العصبية متعاطف خالية من أنواع الخلايا الأخرى 17،23، (ب) متطلبات عامل نمو الخلايا العصبية هي متعاطفة راسخة، والذي يسمح باستخدام تعريف المتوسطة، ومجموعة متنوعة من وسائل الاعلام تعريف، وركا?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من خلال تمويل من المعاهد الوطنية للصحة (منح R21 NS45037 وES014901 R01).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Glass coverslips | Bellco | 1943-10012 | 12 mm Round Coverslip #1 Thickness, German glass |
| Bent tip pipets | Bellco | 1273-50003 | |
| Poly-D-lysine | Sigma | P0899-100MG | Stock solution 1 mg/ml |
| Distilled water | Gibco | 15230 | |
| Fine forceps Dumont no. 4 and 5 | Fine Science Tools (FST) | 11252-30 11241-30 | |
| 20-gauge needles | Becton Dickinson | 305176 | |
| Leibovitz’s L-15 medium | Invitrogen | 11415 | |
| Collagenase | Worthington | 4176 | 1 mg/ml |
| Dispase | Roche | 04942078001 | 5 mg/ml |
| Hank’s balanced salt solution( -Ca,-Mg) | Invitrogen | 14185-052 | |
| DMEM Low glucose | Invitrogen | 11885 | |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030 | 20 mM |
| Insulin/Transferrin/ Selenium | Invitrogen | 51500-056 | 100X |
| Fatty-acid free BSA | Calbiochem | 126609 | |
| NGF | Harlan Bioproducts | 5017 | |
| Ham F-12 nutrient medium (F-12) | Invitrogen | 11765 | |
| Cytosine arabinoside | Sigma | C1768 | |
| Matrigel | BD Biosciences | 356234 | Avoid repeated freeze-thaw cycles |
| BMP-7 | R&D Systems Curis, Inc. | 345-BP BMP7-07H | BMPs 4, 5 and 6 work equally as well as BMP-7 and are sometimes easier to obtain commercially |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Triton X-100 | Fisher | BP151-500 | |
| Mouse anti-rat MAP2 antibody | Sternberg Monoclonals Inc. | SMI52 | 1/5000 |
| Alexa Fluor 546 goat-anti-mouse | Invitrogen | A11003 | 1/10000 |
| Mounting media | Prolong Antifade kit Molecular Probes | P7481 |
Table 1. Materials.
References
- Purpura, D. P., Quarton, Q. C., Melnechuk, T., Schmitt, F. O. . The Neurosciences: A Study Program. , 372-393 (1967).
- Purves, D. Functional and structural changes in mammalian sympathetic neurons following interruption of their axons. J. Physiol. 252, 429-463 (1975).
- Purves, D. . A Trophic Theory of Neural Connections. , (1988).
- Miller, J. P., Jacobs, G. A. Relationships between neuronal structure and function. J. Exp. Biol. 112, 129-145 (1984).
- Schuman, E. M. Synapse specificity and long-term information storage. Neuron. 18, 339-342 (1997).
- Sejnowski, T. J. The year of the dendrite. Science. 275, 178-179 (1997).
- Berger-Sweeney, J., Hohmann, C. F. Behavioral consequences of abnormal cortical development: insights into developmental disabilities. Behav. Brain Res. 86, 121-142 (1997).
- Connors, S. L. Fetal mechanisms in neurodevelopmental disorders. Pediatric Neurology. 38, 163-176 (2008).
- Pardo, C. A., Eberhart, C. G. The neurobiology of autism. Brain Pathology (Zurich, Switzerland). 17, 434-447 (2007).
- Zoghbi, H. Y. Postnatal neurodevelopmental disorders: meeting at the synapse. Science. 302, 826-830 (2003).
- de Ruiter, J. P., Uylings, H. B. Morphometric and dendritic analysis of fascia dentata granule cells in human aging and senile dementia. Brain Res. 402, 217-229 (1987).
- Flood, D. G., Coleman, P. D. Hippocampal plasticity in normal aging and decreased plasticity in Alzheimer’s disease. Prog. Brain Res. 83, 435-443 (1990).
- Jagadha, V., Becker, L. E. Dendritic pathology: an overview of Golgi studies in man. Can. J. Neurol. Sci. 16, 41-50 (1989).
- Bruckenstein, D. A., Higgins, D. Morphological differentiation of embryonic rat sympathetic neurons in tissue culture. I. Conditions under which neurons form axons but not dendrites. Dev. Biol. 128, 324-336 (1988).
- Tropea, M., Johnson, M. I., Higgins, D. Glial cells promote dendritic development in rat sympathetic neurons in vitro. Glia. 1, 380-392 (1988).
- Lein, P. The effects of extracellular matrix and osteogenic protein-1 on the morphological differentiation of rat sympathetic neurons. Int. J. Dev. Neurosci. 14, 203-215 (1996).
- Lein, P., Johnson, M., Guo, X., Rueger, D., Higgins, D. Osteogenic protein-1 induces dendritic growth in rat sympathetic neurons. Neuron. 15, 597-605 (1995).
- Lein, P. J., Higgins, D. Laminin and a basement membrane extract have different effects on axonal and dendritic outgrowth from embryonic rat sympathetic neurons in vitro. 136, 330-345 (1989).
- Higgins, D., Lein, P. J., Osterhout, D. J., Johnson, M. I., Banker, G., Goslin, K. . Culturing Nerve Cells. , 177-295 (1991).
- Beck, H. N., Drahushuk, K., Jacoby, D. B., Higgins, D., Lein, P. J. Bone morphogenetic protein-5 (BMP-5) promotes dendritic growth in cultured sympathetic neurons. BMC Neurosci. 2, 12-12 (2001).
- Guo, X., Rueger, D., Higgins, D. Osteogenic protein-1 and related bone morphogenetic proteins regulate dendritic growth and the expression of microtubule-associated protein-2 in rat sympathetic neurons. Neurosci. Lett. 245, 131-134 (1998).
- Lein, P. J. Glia induce dendritic growth in cultured sympathetic neurons by modulating the balance between bone morphogenetic proteins (BMPs) and BMP antagonists. J. Neurosci. 22, 10377-10387 (2002).
- Higgins, D., Lein, P., Osterhout, D., Johnson, M. I., Banker, G., Goslin, K. . Culturing Nerve Cells. , 177-205 (1991).
- Bruckenstein, D. A., Higgins, D. Morphological differentiation of embryonic rat sympathetic neurons in tissue culture. II. Serum promotes dendritic growth. Dev. Biol. 128, 337-348 (1988).
