גרימת צמיחה הדנדריטים בנוירונים אוהדים מתורבתים

Summary

אנו מתארים באמצעות פרוטוקול המוךפו"גנטי שהולך העצם חלבונים 7 (BMP-7) או Matrigel סלקטיבי לגרום לצמיחה הדנדריטים בנוירונים אוהדים העיקריים הסתייגותם מן הגרעינים צוואר הרחם מעולה (SCG) של חולדות הלידה.

Abstract

הצורה של הדנדריטים ארבור קובע את הקלט הסינפטי הכולל תא עצב יכול לקבל ^1-3, ומשפיע סוגי והפצה של תשומות אלה ^4-6. דפוסי שינה של צמיחה הפלסטיות דנדריטים והן קשורות עם תפקוד לקוי neurobehavioral במודלים ניסיוניים ^7, והם חשבו לתרום סימפטומים קליניים שנצפה בשתי ^8-10 הפרעות התפתחותיות ומחלות ניווניות ^11-13. תצפיות אלו מדגישים את החשיבות התפקודית של ויסות בדיוק מורפולוגיה הדנדריטים, וסבורים כי מנגנוני זיהוי השולטים הצמיחה הדנדריטים לא רק לקדם את ההבנה של כמה עצבי קישוריות מוסדר במהלך התפתחות תקינה, אבל עשויה גם לספק תובנות על אסטרטגיות טיפולית חדשנית למחלות נוירולוגיות שונות.

מחקרים שיבדקו את המנגנונים של צמיחת הדנדריטים יהיה להקל במידה רבה על ידי זמינות Ofa מערכת מודל המאפשר נוירונים כדי לפעול באופן ניסיוני ממצב שבו הם לא להאריך דנדריטים אחד שבו הם לפרט ארבור הדנדריטים דומה לזה של עמיתיהם שלהם vivo. תרבויות העיקריות של נוירונים אוהדים הסתייגותם מן הגרעינים צוואר הרחם מעולה (SCG) של מכרסמים סביב הלידה לספק מודל כזה. כאשר בתרבית מוגדר בינוני בהעדר מתאי גליה בסרום ו ganglionic, הנוירונים אוהדים להאריך את תהליך יחיד אשר axonal, ואת זה המדינה חד קוטבי נמשכת שבועות עד חודשים בתרבות ^14,15. עם זאת, תוספת של המוךפו"גנטי שהולך או עצם חלבונים 7 (BMP-7) ^16,17 או ¹⁸ Matrigel עד בינוני התרבות מפעילה נוירונים אלה כדי להרחיב את התהליכים רבים העונים על קריטריונים מורפולוגיים, ביוכימיים ופונקציונלי של דנדריטים. נוירונים אוהדים הסתייגותם מן SCG של מכרסמים סביב הלידה ו שגודלו בתנאים מוגדרים הם אוכלוסייה הומוגנית של נוירונים ¹⁹שמגיבים בצורה אחידה לפעילות דנדריט, קידום של Matrigel, BMP-7 ו BMPs אחרים של decapentaplegic (DPP) ו 60A subfamilies ^17,18,20,21. חשוב לציין, Matrigel-BMP ו-Induced דנדריט היווצרות מתרחשת בהיעדר שינויים הישרדות התא או צמיחה axonal ^17,18.

כאן, נתאר כיצד להגדיר את תרבויות הסתייגותם של נוירונים אוהדים הנגזרות SCG של חולדות סביב הלידה, כך שהם מגיבים על פעילות דנדריט, קידום סלקטיבי של Matrigel או BMPs.

Protocol

1. הכנת בינוני תרבות (בינוני C2)

1. להוסיף את הדברים הבאים, על מנת ברשימה, כדי סטרילית, חד פעמי בקבוק 500 מ"ל Erlenmeyer:

   כמות	רכיב	ריכוז סופי
   190 מ"ל	DMEM (גלוקוז נמוכה)	N / A
   10 מ"ל	חומצת שומן חופשית BSA (20mg/ml ב DMEM)	50 מיקרוגרם / מ"ל
   2.8 מ"ל	L-גלוטמין	1.4 mM
   ....

Discussion

היתרונות של מודל זה הם: (א) תרבויות מורכבות של אוכלוסייה הומוגנית של נוירונים אוהדים חסרי סוגי תאים אחרים ^17,23 (ב) גורם הגדילה הדרישות של נוירונים הם אוהדים מבוססת היטב, אשר מאפשר את השימוש בינוני מוגדר, וכן מגוון של כלי התקשורת מוגדרים, מצעים לעבוד היטב לגידול ושמירה על נוירונים אוהדים ²³ (ג) הנוירונים בתרביות אלה מגיבים באופן אחיד לפעילות דנדריט, קידום של Matrigel, BMP-7 ו BMPs אחרים של DPP ו 60A subfamilies ^17,18,20,21, ו (ד) Matrigel או BMP-In.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
שם מגיב	חברה	מספר קטלוגי	תגובות
זכוכית coverslips	Bellco	1943-10012	12 עגול מ"מ coverslip # 1 עובי, זכוכית הגרמני
בנט עצה pipets	Bellco	1273-50003
פולי-D-ליזין	סיגמא	P0899-100 מ"ג	המניות פתרון 1 מ"ג / מ"ל
מים מזוקקים	Gibco	15230
בסדר מלקחיים Dumont לא. 4 ו 5	מדע כלים עדינים (FST)	11252-30 11241-30
20 מד מחטים	בקטון דיקינסון	305176
ליבוביץ של L-15 בינוני	Invitrogen	11415
Collagenase	וורטינגטון	4176	1 מ"ג / מ"ל
Dispase	רוש	04942078001	5 מ"ג / מ"ל
האנק של פתרון מאוזן מלח (-Ca, מ"ג)	Invitrogen	14185-052
DMEM נמוכה לגלוקוז	Invitrogen	11885
L-גלוטמין	Invitrogen	25030	20 מ"מ
אינסולין / transferrin / סלניום	Invitrogen	51500-056	100x
שומן חומצה חינם BSA	Calbiochem	126609
NGF	הרלן Bioproducts	5017
חם בינוני F-12 מזין (F-12)	Invitrogen	11765
ציטוסין arabinoside	סיגמא	C1768
Matrigel	BD Biosciences	356234	למנוע הופעה חוזרת של ההקפאה, ההפשרה מחזורי
BMP-7	R & D מערכות Curis, Inc	345-BP BMP7-07H	BMPs 4, 5 ו - 6 עובדים באותה מידה כמו גם BMP-7 ו לפעמים יותר קל להשיג באופן מסחרי
Paraformaldehyde	סיגמא	P6148
טריטון X-100	דיג	BP151-500
עכבר נגד עכבר MAP2 נוגדן	שטרנברג Monoclonals בע"מ	SMI52	1/5000
Alexa פלואוריד 546 עז נגד העכבר	Invitrogen	A11003	1/10000
הרכבה התקשורת	להאריך את בדיקות Antifade ערכת מולקולרית	P7481