En Cre-Lox P Rekombination metoden för detektion av cellfusion In Vivo</em
Summary
En metod för att spåra Cellfusion i levande organismer över tid beskrivs. Den metod som använder Cre-<em> LoxP</em> Rekombination att inducera luciferas uttryck på cellfusion. Den självlysande signalen genereras kan upptäckas i levande organismer med hjälp av Biophotonic bildsystem med en känslighet för upptäckt av ~ 1000 celler i perifer vävnad.
Abstract
Förmågan hos två eller flera celler av samma typ att säkringen har använts i metazoans genom evolutionen för att bilda många komplexa organ, inklusive skelettmuskel, ben och moderkakan. Samtida studier visar fusion av celler av samma typ som ger ökad funktion. Till exempel, när trofoblasten cellerna i moderkakan säkring för att bilda syncytiotrophoblast är syncytiotrophoblast bättre kunna transportera näringsämnen och hormoner över moder och foster barriär än icke kondenserad trophoblasts 1-4. Nyare studier visar sammansmältning av celler av olika typer kan direkt cell öde. Den "reversion" eller modifiering av cell öde genom fusion var en gång tänkt att vara begränsad till system cellkultur. Men tillkomsten av stamcellstransplantation ledde till upptäckten av oss och andra som stamceller kan smälta samman med somatiska celler in vivo och att fusion underlättar stamceller differentiering 5-7. Således är Cellfusion en reglerad process Capable främja cellens överlevnad och differentiering och därmed kan vara av central betydelse för utvecklingen, reparation av vävnad och till och med patogenesen av sjukdomar.
Begränsa studien av cellfusion, är bristen på lämplig teknik för att 1) korrekt identifiera fusion produkter och 2) produkter spåra fusion över tiden. Här presenterar vi en ny metod för att behandla både begränsningar via induktion av mareld vid fusion (figur 1). Mareld kan detekteras med hög känslighet in vivo 8-15 Vi använder en konstruktion kodning för Firefly luciferas (Photinus pyralis) gen placeras nära ett stopp kodon flankeras av LoxP sekvenser. När celler som uttrycker denna gen säkring med celler som uttrycker Cre recombinase protein, är de LoxP platser klyvs och stoppsignal är censurerade så att transkription av luciferas. Eftersom signalen induciBLE, är förekomsten av falskt positiva signaler mycket låg. Till skillnad från existerande metoder som utnyttjar Cre / LoxP systemet 16, 17, har vi bildat en "levande" upptäckt signalen och därmed ger för första gången möjlighet att spåra kinetik cellfusion in vivo.
För att visa den metod som serveras möss ubiquitously uttrycka Cre recombinase som mottagare av stamceller transfekterade med en konstruktion för att uttrycka luciferas nedströms en floxed stop kodon. Transplanterades stamceller via intramyocardial injektion och efter transplantation intravital bildanalys utfördes för att spåra förekomsten av fusion produkter i hjärtat och omgivande vävnader över tid. Detta tillvägagångssätt skulle kunna anpassas för att analysera Cellfusion i någon vävnadstyp i något stadium av utveckling, sjukdom eller en vuxen vävnad reparera.
Protocol
Discussion
Den metod som beskrivs här tillåter för första gången, diskret identifiering och temporal analys av cellfusion i organismer, inklusive små djur. Den metod som kombinerar Cre-LoxP rekombination med efterföljande Biophotonic bildanalys. Tillvägagångssättet är mottaglig för spårning inte bara cell-cell fusion, men även virus-cell fusion och detta kan visa sig användbart för att spåra virusinfektioner. Bildanalys är snabb och det är möjligt att bild flera små djur samtidigt. Upptäckt av fusion …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna vill tacka Dr Peiman Hemmati (Institutionen för medicin, University of Wisconsin-Madison) för generöst ge H1 MSC, och Dr Tim Hacker, Dr Gouqing Song och Ms Jill Koch vid University of Wisconsin Kardiovaskulär fysiologi Core Facility för att utföra mus operationer. Detta arbete stöddes av National Science Foundation genom en Graduate Research Fellowship till Brian Freeman och NIH R21 HL089679.
Materials
| Name of reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Neon Transfection System | Invitrogen, Carlsbad, CA | MPK5000 | |
| Neon 100 μL Kit | Invitrogen, Carlsbad, CA | MPK10025 | Contains R and E Buffer |
| a-MEM powder | Invitrogen, Carlsbad, CA | 12000-022 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone, Logan UT | SH30070.03 | |
| B6.C-Tg(CMV-cre)1Cgn/J | Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME | 006054 | |
| Trypsin 10X | Fisher Scientific, Forest Lawn, NJ | MT-25-054-Cl | |
| L-Glutamine | Fisher Scientific, Forest Lawn, NJ | 25030-081 | |
| D-Luciferin | Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA | 122796 | |
| Xenogen Biophotonic Imaging System | Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA | IVIS Spectrum | |
| Sodium Biocarbonate | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | S6014-500G | |
| Non-essential Amino Acids | Invitrogen, Carlsbad, CA | 11140-050 |
References
- Bernirschke, K. K. P. . Pathology of the Human Placenta. , (2000).
- Hoshina, M., Boothby, M., Boime, I. Cytological localization of chorionic gonadotropin alpha and placental lactogen mRNAs during development of the human placenta. J. Cell. Biol. 93, 190-198 (1982).
- Johansen, M., Redman, C. W., Wilkins, T., Sargent, I. L. Trophoblast deportation in human pregnancy–its relevance for pre-eclampsia. Placenta. 20, 531-539 (1999).
- Redman, C. W., Sargent, I. L. Placental debris, oxidative stress and pre-eclampsia. Placenta. 21, 597-602 (2000).
- Ogle, B. M. Spontaneous fusion of cells between species yields transdifferentiation and retroviral transfer in vivo. FASEB. J. 18, 548-550 (2004).
- Nygren, J. M. Bone marrow-derived hematopoietic cells generate cardiomyocytes at a low frequency through cell fusion, but not transdifferentiation. Nat. Med. 10, 494-501 (2004).
- Nygren, J. M. Myeloid and lymphoid contribution to non-haematopoietic lineages through irradiation-induced heterotypic cell fusion. Nat. Cell. Biol. 10, 584-592 (2008).
- Kutschka, I. Adenoviral human BCL-2 transgene expression attenuates early donor cell death after cardiomyoblast transplantation into ischemic rat hearts. Circulation. 114, I174-I180 (2006).
- Min, J. J. In vivo bioluminescence imaging of cord blood derived mesenchymal stem cell transplantation into rat myocardium. Ann. Nucl. Med. 20, 165-170 (2006).
- Malstrom, S. E., Tornavaca, O., Meseguer, A., Purchio, A. F., West, D. B. The characterization and hormonal regulation of kidney androgen-regulated protein (Kap)-luciferase transgenic mice. Toxicol. Sci. 79, 266-277 (2004).
- Weir, L. R. Biophotonic imaging in HO-1.luc transgenic mice: real-time demonstration of gender-specific chloroform induced renal toxicity. Mutat. Res. 574, 67-75 (2005).
- Rajashekara, G., Glover, D. A., Banai, M., O’Callaghan, D., Splitter, G. A. Attenuated bioluminescent Brucella melitensis mutants GR019 (virB4), GR024 (galE), and GR026 (BMEI1090-BMEI1091) confer protection in mice. Infect. Immun. 74, 2925-2936 (1090).
- Kadurugamuwa, J. L. Noninvasive biophotonic imaging for monitoring of catheter-associated urinary tract infections and therapy in mice. Infect. Immun. 73, 3878-3887 (2005).
- Ryan, P. L., Youngblood, R. C., Harvill, J., Willard, S. T. Photonic monitoring in real time of vascular endothelial growth factor receptor 2 gene expression under relaxin-induced conditions in a novel murine wound model. Ann. N.Y. Acad. Sci. 1041, 398-414 (2005).
- Zhu, L. Non-invasive imaging of GFAP expression after neuronal damage in mice. Neurosci. Lett. 367, 210-212 (2004).
- Noiseux, N. Mesenchymal stem cells overexpressing Akt dramatically repair infarcted myocardium and improve cardiac function despite infrequent cellular fusion or differentiation. Mol. Ther. 14, 840-850 (2006).
- Ajiki, T. Composite tissue transplantation in rats: fusion of donor muscle to the recipient site. Transplant Proc. 37, 208-209 (2005).
- Trivedi, P., Hematti, P. Derivation and immunological characterization of mesenchymal stromal cells from human embryonic stem cells. Exp. Hematol. 36, 350-359 (2008).
- Ogle, B. M., Cascalho, M., Platt, J. L. Biological implications of cell fusion. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 6, 567-575 (2005).
- Collins, T. J. ImageJ for microscopy. BioTechniques. 43, 25-30 (2007).
