细胞迁移等细胞过程传统上是在二维刚性塑料表面进行研究的。本报告描述了一种技术，可直接观察蛋白质定位，并分析在更接近生理条件的三维基质中迁移细胞内的蛋白质动态变化。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
传统上，细胞迁移是在二维的刚性塑料表面进行研究的。然而，在伤口愈合、组织再生和癌症转移等重要的生物学过程中，细胞必须穿行于复杂、三维的细胞外组织中。为了更深入地理解这些生物学过程背后的机制，研究驱动细胞迁移的相关蛋白质的作用至关重要。本文介绍了一种利用上皮细胞系（MDCK）和一种三维纤维状自聚合基质作为模型系统来研究细胞迁移机制的实验方案。这种光学透明的细胞外基质易于进行活细胞成像研究，且能更好地模拟生理条件下的柔软组织环境。本报告展示了一种直接可视化蛋白质定位与动态变化以及周围三维基质形变的技术。
在细胞过程中研究蛋白质的定位与动态变化，可为理解蛋白质功能提供关键信息。基因编码的荧光标签为观察蛋白质定位和动态提供了一种独特的方法。利用该技术，我们能够实时分析细胞在基质中移动时，关键的、产生力学作用的细胞骨架组分在亚细胞结构中的聚集情况。此外，通过使用不同波长的多种荧光标签，我们可以同时检测多种蛋白质的定位，从而能够检验例如不同蛋白质是否具有相似或不同的功能。进一步地，荧光标记蛋白质的动态行为可通过光漂白后荧光恢复（FRAP）分析进行定量。该检测方法可评估蛋白质的移动性及其与细胞骨架网络结合的稳定性。
通过将活细胞成像与蛋白质功能抑制剂处理相结合，我们可以实时观察迁移细胞中蛋白质分布和细胞形态的变化。此外，我们还将活细胞成像与嵌入基质中的荧光示踪颗粒相结合，以可视化细胞迁移过程中基质的形变。因此，我们可以观察到迁移细胞如何分布产生力的蛋白质，以及牵引力施加于周围基质的位置。通过这些技术，我们能够深入了解特定蛋白质的作用及其在细胞迁移机制中的贡献。
方案
1. 稳定细胞系的构建（例如 MDCK 细胞）
- 在 p35 培养皿中以 80–90% 汇合度接种细胞。避免细胞形成 100% 汇合的单层，否则会降低转染效率。
- 使用 Lipofectamine 2000 将目的质粒转染至细胞中。根据制造商提供的方案优化转染条件。
- 次日，将细胞传代至两个 p150 培养皿中。建议使用大培养皿，以便稳定克隆之间有足够的间距。
- 次日，更换培养基，并向每个培养皿中加入 500 μg/ml 的 G418。G418 的浓度应根据不同的细胞系进行优化。
- 每隔一天更换一次培养基，持续约 2 周。2 周后，应开始出现对 G418 抗性的克隆，并可通过肉眼观察到。
- 使用倒置荧光显微镜识别 GFP 阳性克隆。使用记号笔在培养皿上标记这些克隆的位置。
- 为选择性地消化克隆，吸除培养基，并用 PBS 或胰蛋白酶溶液洗涤细胞两次。第二次洗涤时，不要完全吸除液体，保留一层薄液以防止细胞干燥。
- 对于每个标记的克隆：使用无菌棉签尽可能贴近克隆边缘擦拭，形成一个包含细胞克隆的湿润区域孤岛。向克隆上加入 10 μl 胰蛋白酶。对每个克隆重复此操作，并迅速进行以避免干燥。经验丰富的研究人员通常可在每个 p150 培养皿中挑取约 12 个克隆。
- 将培养皿在 37 °C 下孵育 5–10 分钟，直至细胞从培养皿上脱落并呈圆形。
- 对于每个克隆....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
本文介绍了一种利用活细胞成像技术在三维基质中研究细胞迁移机制的方法。该技术的成功依赖于获得稳定表达GFP标记蛋白的“优质”克隆。GFP蛋白表达水平过低将需要过强的激发光照射，从而影响细胞健康；而表达水平过高则会对细胞产生不良的副作用。因此，选择合适的载体将基因转染至细胞中至关重要（例如启动子、荧光标签等）。除GFP外，还有多种其他荧光标签可供选择，包括红色荧光蛋白（RFP）7,8。这些蛋白标签需要特定波长的激发光，因此需使用不同的荧光滤光片组合。此外，还可利用不同的抗生素抗性基因（如G418、潮霉素、嘌呤霉素等）筛选并建立稳定表达的克隆。
对于活细胞成像，也可使用瞬时转染的细胞。尽管这种方法可最大限度减少建立稳定细胞系所需的时间和工作量，但瞬时转染的细胞通常状态不佳，因此在实验中的可靠性较低。此外，瞬时转染细胞群体是由表达与非表达细胞组成的异质性混合物，且表达细胞会随着时间推移逐渐丧失荧光蛋白的表达。相比之下，稳定表达细胞通常由单个细胞克隆扩增而来，其蛋白表达应保持稳定且均一，尽管表达水平通常低于瞬时表达细胞。由于稳定细胞克隆很可能起源于单个细胞，因此在筛选.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
致谢
感谢 Grant Sumida 博士对本文稿的审阅。本工作得到了贝克曼青年研究员奖（SY）、赫尔曼家族新教员奖（SY）、美国国立卫生研究院 EUREKA 奖以及加州大学癌症研究协调委员会的资助。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 胶原蛋白，牛源，I型 | BD Biosciences | 354231 | 储存浓度约为 3 mg/ml |
| 3-氨基丙基三甲氧基硅烷 | Sigma-Aldrich | 281778 | 用水稀释 |
| 戊二醛 | Sigma-Aldrich | 340855 | 用PBS稀释 |
| 1M Hepes | Invitrogen | 15630-080 | |
| Fluospheres 聚苯乙烯微球 1 μm，红色荧光 (580/605) | Invitrogen | F13083 | |
| 遗传霉素（G418） | Invitrogen | 11811-031 | |
| DMEM | Invitrogen | 31600-034 | |
| 胎牛血清 | Atlanta Biologicals | S115500 | |
| 青霉素/链霉素 | Invitrogen | 15140-122 | |
| 卡那霉素 | Invitrogen | 15160-054 |
参考文献
- Shih, W., Yamada, S., Myosin, A dependent retrograde flow drives 3D cell migration. Biophys. J. 98 (8), L29-L31 (2010).
- O'Brien, L. E., Yu, W., Tang, K., Jou, T. S., Zegers, M. M., Mostov, K. E. Morphological and biochemical analysis of Rac1 in three-dimensional epithelia....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
