이러한 세포 마이 그 레이션으로 세포 프로세스 전통적으로 2 차원, 딱딱한 플라스틱 표면에 연구하고 있습니다. 이 보고서는 직접 단백질 지방화를 시각화하고보다 생리학 관련, 3 차원 매트릭스에서 마이 그 레이션 세포의 단백질 역학을 분석하는 기술을 설명합니다.
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이 논문에서
요약
초록
전통적으로, 세포 마이 그 레이션은 2 차원, 딱딱한 플라스틱 표면에서 연구되었습니다. 그러나, 상처 치료, 조직 재생 및 암 전이 중요한 생물 학적 과정 동안 세포는 복잡한, 3 차원 세포 조직을 통해 이동해야합니다. 더 나은 이러한 생물 학적 과정의 배후 메커니즘을 이해하기 위해서는 세포 마이 그 레이션을 운전을 담당하는 단백질의 역할을 검토하는 것이 중요합니다. 여기, 우리는 상피 세포 라인을 (MDCK)를 사용하여 셀 마이 그 레이션의 메커니즘을 연구하기위한 프로토콜을 개요 및 모델 시스템으로 3 차원, 섬유, 자기 polymerizing 매트릭스. 이 광학 명확 세포외 매트릭스는 라이브 세포 이미징 연구에 쉽게 의무가 있으며, 더 좋은 방법은 생리, 부드러운 조직 환경을 모방한 것이었 지요. 이 보고서는 직접 단백질 현지화 및 역학을 시각에 대한 기술, 그리고 주변의 세 차원 매트릭스의 변형을 보여줍니다.
시험세포 공정 중에 단백질 현지화 및 역학 ination 단백질의 기능에 중요한 통찰력을 제공합니다. 유전자 인코딩 형광 태그는 단백질 현지화 및 역학을 관찰에 대해 고유한 방법을 제공합니다. 이 기법을 사용하여 우리가 키 subcellular 축적을 분석할 수, 강제로 생성 매트릭스를 통해 세포 기동으로 실시간으로 cytoskeletal 구성 요소를. 또한, 서로 다른 파장 여러 형광 태그를 사용하여, 우리는 따라서 우리는 서로 다른 단백질이 비슷하거나 분기하는 역할을 가지고 있는지, 예를 들어, 테스트 수 있도록, 동시에 여러 단백질의 지방화를 검사할 수 있습니다. 또한, 찬란 태그 단백질의 역학은 (FRAP) 분석을 Photobleaching 후 형광 복구를 사용하여 계량하실 수 있습니다. 이 측정 assays는 단백질 이동성과 방법을 안정적으로 단백질을 구속은 cytoskeletal 네트워크에 있습니다.
단백질 기능 억제제의 치료와 함께 라이브 세포 이미징을 결합함으로써,우리는 단백질과 마이 그 레이션 세포의 형태의 배포판에 실시간으로 변경 확인할 수 있습니다. 또한, 우리는 셀 마이 그 레이션하는 동안 행렬 변형을 시각화하기 위해 매트릭스 내에 포함된 형광 추적 입자의 사용과 라이브 세포 이미징을 결합하여. 따라서, 우리는 마이 그 레이션 세포는 강제로 생성 단백질을 배포하는 방법 시각화 수 있으며, 어디 견인 세력은 주변 매트릭스 끼쳤다 있습니다. 이러한 기술을 통해, 우리는 세포 이주의 메커니즘에 특정 단백질과 공헌의 역할에 가치있는 통찰력을 얻을 수 있습니다.
프로토콜
1. 안정적인 세포주의 생성 (예 : MDCK 세포)
- p35 접시에 confluency 80~90%에서 플레이트 세포. 세포 transfection 효율을 줄일 수 백퍼센트 합류 monolayer를 형성하게하지 마십시오.
- Lipofectamine 2000을 사용하는 관심의 플라스미드와 세포 Transfect. 제조 업체의 프로토콜을 사용하여 transfection 조건을 최적화합니다.
- 다음날,이 통로 p150 배양 접시에 세포. 큰 접시는 안정적인 식민지 사이에 충분한 간격을 허용하는 것이 좋습니다.
- 다음날, 미디어를 변경하고 각각의 접시 500 μg / G418의 ML을 추가합니다. G418의 농도는 각각의 세포 라인에 최적화된해야합니다.
- 약 2 주 동안 매일 미디어를 변경합니다. 이주 후, G418 방지 식민지가 형성되기 시작하고, 육안으로 볼 수 있습니다.
- 거꾸로 형광 현미경을 사용하여 GFP 긍정적인 식민지를 확인합니다. sharpie 펜을 사용하여 접시에 이러한 식민지를 표시합니다.
- s의electively, 조직 문화 판에서 식민지 trypsinize 미디어를 대기음, 그리고 PBS 또는 트립신 솔루션으로 두 번 세포를 씻으십시오. 두 번째 세척에서 모든 ....
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토론
여기서 우리는 3 차원 매트릭스의 세포 이주의 메커니즘을 연구 라이브 세포 이미징을 사용하는 방법을 설명합니다. 이 기술의 성공은 안정적으로 GFP - 태그 단백질을 표현하는 "좋은"클론을 얻는 방법에 따라 달라집니다. GFP 단백질의 낮은 수준이 너무 높은 GFP 레벨 셀에 바람직하지 않은 부작용이되지만, 세포의 건강을 위태롭게 할 여분의 자극에 노출이 필요합니다. 따라서 세포에 유전자를 transfect하는 벡터 선택 (예 : 발기인, 형광 태그 등) 중요합니다. 적색 형광 단백질 (RFP) 7,8 포함하여 GFP, 이외의 많은 형광 태그가 있습니다. 이러한 단백질 태그는 특정 여기 빛의 파장과 형광 필터 따라서 다른 집합이 필요합니다. 또한, 다른 항생제 내성 유전자 (예, G418, hygromycin, puromycin 등)도 가능하며 안정적인 클론을 생성하는 데 사용할 수 있습니다.
라이브 세포 이미징을위한, transientl.......
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공개 사항
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
감사의 글
우리는 원고의 중요한 읽기위한 박사님 스미다 감사합니다. 이 작품은 베크 만 젊은 탐정 수상 (SY), 헬맨 가족 새로운 교수진 수상 (SY), NIH 유레카, 캘리포니아 암 연구 조정위원회의 대학에 의해 지원되었다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 시약의 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
| 콜라겐은 소, 전을 입력합니다 | BD Biosciences | 354,231 | 주식 3 MG / ML에 관한 |
| 3 aminopropyltrimethoxysilane | 시그마 알드리치 | 281,778 | 물에 희석 |
| 글루 타 알데히드 | 시그마 알드리치 | 340,855 | PBS에 희석 |
| 1M Hepes | Invitrogen | 15630-080 | |
| Fluospheres의 폴리스티렌 microspheres 1 μm의 빨강, 형광 (605분의 580) | Invitrogen | F13083 | |
| Geneticin (G418) | Invitrogen | 11811-031 | |
| 문화 미디어 구성 요소 : | |||
| DMEM | Invitrogen | 31600-034 | |
| 태아 소 혈청 | 애틀랜타 체액 | S115500 | |
| 페니실린 / 스트렙토 마이신 | Invitrogen | 15140-122 | |
| Kanamycin | Invitrogen | 15160-054 |
참고문헌
- Shih, W., Yamada, S., Myosin, A dependent retrograde flow drives 3D cell migration. Biophys. J. 98 (8), L29-L31 (2010).
- O'Brien, L. E., Yu, W., Tang, K., Jou, T. S., Zegers, M. M., Mostov, K. E. Morphological and biochemical analysis of Rac1 in three-dimensional epithelia....
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