تطبيق MassSQUIRM لقياسات كمية من نشاط Demethylase ليسين
Summary
نحن نقدم طريقة لاستخدام MALDI قياس الطيف الكتلي والاختزالية الكيمياء مثيلة لقياس التغيرات في مثيلة ليسين.
Abstract
مؤخرا، تم اكتشاف المنظمين جينية واللاعبين الرئيسيين في العديد من الأمراض المختلفة 1-3. ونتيجة لذلك، هذه الانزيمات من الاهداف الرئيسية لدراسات جزيء صغير والمخدرات 4 التنمية. المنظمين جينية كثيرة في الآونة الأخيرة فقط تم اكتشاف و لا تزال في طور تصنيفها. من بين هذه الانزيمات هي demethylases ليسين التي إزالة مجموعات الميثيل من lysines على histones والبروتينات الأخرى. نظرا لطبيعة رواية من هذا النوع من الانزيمات، وقد وضعت بعض المقايسات لدراسة نشاطها. وكان هذا كتلة الطريق إلى تصنيف كل من وعالية الإنتاجية من الدراسة demethylases هيستون. حاليا، المقايسات demethylase عدد قليل جدا من الوجود. تلك التي لا توجد تميل الى ان تكون ذات طابع نوعي، ولا يمكن تبين في وقت واحد بين الولايات مثيلة ليسين مختلفة (الامم المتحدة، أحادي، ثنائي وثلاثي). ويشيع استخدام الطيف الكتلي لتحديد نشاط demethylase ولكن هل الحالي المقايسات الطيفي الشامللا تتناول ما إذا الببتيدات ميثليته تفاضلي تأين بشكل مختلف. التأين الفرق من الببتيدات ميثليته يجعل من الصعب المقارنة بين الولايات مثيلة وبالتأكيد ليس كمي (الشكل 1A). وبالتالي ليست الأمثل المقايسات المتاحة لتحليل شامل للنشاط demethylase.
نحن هنا وصف طريقة تسمى MassSQUIRM (تحديد الكميات الطيفي الشامل باستخدام مثيلة الاختزالية النظائر) والتي تقوم على مثيلة الاختزالية للجماعات أمين مع الفورمالدهيد deuterated لاجبار جميع lysines ليكون ثنائي ميثليته، مما يجعلها أساسا الأنواع الكيميائية نفسها، وبالتالي تأيين نفس (الشكل 1B). الفرق الكيميائية فقط بعد مثيلة الاختزالية هو الهيدروجين والديوتيريوم، الذي لا يؤثر على الكفاءة التأين MALDI. الفحص MassSQUIRM غير محددة لمنتجات التفاعل مع demethylase lysines الامم المتحدة، أحادية أو ثنائي ميثليته. الفحص ينطبق أيضا على methyltransferases يسين إعطاء SAلي منتجات التفاعل. هنا، ونحن نستخدم مزيج من الكيمياء مثيلة الاختزالية وMALDI مطياف الكتلة لقياس نشاط LSD1، وهو demethylase يسين قادر على إزالة ثنائي وأحادي الميثيل الجماعات، على ركيزة الببتيد الاصطناعية 5. هذا الفحص بسيط وقابلة بسهولة إلى أي مختبر مع الوصول إلى مطياف الكتلة MALDI في المختبر أو من خلال مرفق البروتيوميات. الفحص له ~ 8 أضعاف نطاق الدينامية وغير قابلة للتطوير بسهولة على شكل لوحة 5.
Protocol
Discussion
MassSQUIRM هي طريقة غير مكلفة والكمية لتحليل شامل لنشاط demethylases يسين المشاركين في أحادية و ثنائي مثيلة. MassSQUIRM تقدم الكميات ليس فقط من نتاج رد فعل، بل أيضا من أجل وسيطة. ويمكن استخدام هذا الاختبار باعتبارها أداة قوية في دراسة آلية demethylases هيستون LSD1 وغيرها. وسوف يكون من المفيد…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر مرفق البروتيوميات UAMS الطيفي للحصول على الدعم الشامل. وقدم التمويل لهذا المشروع من خلال منح المعاهد الوطنية للصحة P20RR015569، P20RR016460 وR01DA025755.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| LSD1 | BPS Biosciences | 50100 |
| H3K4me2-biotin peptide | prepared in-house | none |
| POROS R2 20 micron beads | Applied Biosystems | 1-1129-06 |
| C18 ZipTip | Millipore | ZTC18M |
| Trifluoroacetic acid (TFA) | Thermo | 28904 |
| acetonitrile | Fisher | A996 |
| 2,5-dihydroxybenzoic acid | Sigma | 85707 |
| Borane dimethylamine | Sigma | 180238 |
| isotopically heavy d2-formaldehyde | Cambridge Isotope Laboratories | DLM-805-20 |
| Tris | Fisher | BP154 |
| KCl | Fisher | BP366 |
| MgCl2 | Fisher | BP214 |
| Glycerol | Fisher | G33 |
| Formic acid | Fluka | 06440 |
| Methanol | Fisher | A452 |
| Na-phosphate | Fisher | BP329 |
| SpeedVac Concentrator | Savant | DNA110 |
| MALDI-prOTOF mass spectrometer and TOFworks software | PerkinElmerSciex | none |
References
- Goldberg, A. D., Allis, C. D., Bernstein, E. Epigenetics: a landscape takes shape. Cell. 128, 635-638 (2007).
- Kouzarides, T. Chromatin modifications and their function. Cell. 128, 693-705 (2007).
- Blair, L. P., Cao, J., Zou, M. R., Sayegh, J., Yan, Q. Epigenetic Regulation by Lysine Demethylase 5 (KDM5) Enzymes in Cancer. Cancers (Basel). 3, 1383-1404 (2011).
- Cole, P. A. Chemical probes for histone-modifying enzymes. Nat. Chem. Biol. 4, 590-597 (2008).
- Shi, Y. Histone demethylation mediated by the nuclear amine oxidase homolog LSD1. Cell. 119, 941-953 (2004).
- Blair, L. P. MassSQUIRM: An assay for quantitative measurement of lysine demethylase activity. Epigenetics. 6, 490-499 (2011).
- Rayment, I. Three-dimensional structure of myosin subfragment-1: a molecular motor. Science. 261, 50-508 (1993).
- Collom, S. L., Jamakhandi, A. P., Tackett, A. J., Radominska-Pandya, A., Miller, G. P. CYP2E1 active site residues in substrate recognition sequence 5 identified by photoaffinity labeling and homology modeling. Arch. Biochem. Biophys. 459, 59-69 (2007).
- Gradolatto, A. Saccharomyces cerevisiae Yta7 Regulates Histone Gene Expression. Genetics. 179, 291-304 (2008).
- Taverna, S. D. Yng1 PHD finger binding to histone H3 trimethylated at lysine 4 promotes NuA3 HAT activity at Lysine 14 of H3 and transcripiton at a subset of targeted ORFs. Mol. Cell. 24, 785-796 (2006).
