Reproductible écrasement du nerf sciatique de souris et l'évaluation subséquente de la régénération par l'analyse du Mont muscle entier
Summary
Dans ce rapport, nous décrivons une méthode pour écraser la souris nerf sciatique. Cette méthode utilise facilement disponibles pinces hémostatiques et facilement et de façon reproductible produit complet écrasement du nerf sciatique. En outre, nous décrivons une méthode pour préparer montures de muscles entiers appropriés pour l'analyse de la régénération nerveuse après écrasement du nerf sciatique.
Abstract
La régénération dans le système nerveux périphérique (SNP) est largement étudié à la fois pour sa pertinence à la maladie humaine et de comprendre la réponse robuste régénérative montée par les neurones du SNP ce qui pourrait éclairant les échecs de la régénération du SNC 1. Écrasement du nerf sciatique (axonotmésis) est l'un des modèles les plus courants de lésion du nerf périphérique chez les rongeurs 2. Broyage interrompt tous les axones, mais lames de cellules de Schwann basale sont conservés afin que la régénération est optimal 3,4. Cela permet à l'enquêteur d'étudier précisément la capacité d'un axone en croissance pour interagir avec la cellule de Schwann et lames basales 4. Les rats ont généralement été les modèles animaux préférés pour écrasement du nerf expérimentale. Ils sont largement disponibles et leur sang-froid lésé sciatique fournit une approximation raisonnable de lésions nerveuses humaines 5,4. Bien que plus petit en taille que chez le rat nerf, le nerf de la souris a de nombreuses qualités similaires. Mais surtout, énormemodèles électroniques sont de plus en plus précieux en raison de la grande disponibilité de lignées transgéniques permet maintenant une dissection détaillée des molécules individuelles critiques pour la régénération du nerf 6, 7. Enquêteurs antérieures ont utilisé de multiples méthodes pour produire un écrasement du nerf ou d'une blessure, y compris de simples pinces angulaires, pinces, pinces hémostatiques réfrigérés, pinces vasculaires, et les colliers enquêteur conçus 8,9,10,11,12. Les enquêteurs ont également utilisé diverses méthodes de marquage du site, y compris des blessures de suture, des particules de carbone et de billes fluorescentes 13,14,1. Nous décrivons notre méthode pour obtenir un écrasement du nerf sciatique reproductible complète des informations exactes et persistante de marquage de l'écrasement site à l'aide d'une pince fine hémostatiques et de carbone suite à l'écrasement du site de marquage. Dans le cadre de notre description de la procédure écrasement du nerf sciatique, nous avons également inclus une méthode relativement simple de l'ensemble des muscles que nous utilisons pour monter ensuite de quantifier la régénération.
Protocol
Discussion
Nous avons présenté une méthode pour obtenir un écrasement du nerf sciatique avec fiabilité complète marquage précis du site d'écrasement. Tel que mentionné précédemment, écrasement du nerf sciatique est un modèle commun de lésion du nerf périphérique chez la souris et les rats. Bien que chaque méthode d'écrasement a ses avantages et ses inconvénients, nous avons trouvé cette méthode produit un écrasement complet qui a été facile de marquer avec un minimum d'équipements spéciaux (p….
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par le NIH subventions K08NS065157 (à TAF) En outre, le Centre de Penn pour les troubles musculo-squelettiques, P30AR050950 Nombre Prix de l'Institut national de l'arthrite, les maladies musculo-squelettiques et la peau ont soutenu ce travail (TAF et Steven S. Scherer). Enfin, les Shriners de financement pédiatrique semences Research Center (TAF) a soutenu ce travail. Nous tenons à remercier le Dr Young-Jin Fils pour démontrer d'abord toute la montagne procédure et Amy A. Kim pour son aide dans la production des croquis de la figure 1.
Materials
| Name (description/quantity) | Supplier | Catalogue Number |
| Mini Clipper with No. 0000 Blade | Roboz | RC-5903 |
| Nair Hair Remover (9 oz.) | Church and Dwight Co., Inc. | N/A |
| Betadine Surgical Scrub (1 gallon) | Fisher Scientific | 19066452 |
| Ophthalmic Ointment (1 oz.) | Fisher Scientific | 19082795 |
Surgical Tools:
| Name (description/quantity) | Supplier | Catalogue Number |
| FST 250 Hot bead sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 |
| Iris Scissors (11 cm long) | World Precision Instruments | 500216 |
| Potts-Smith Forceps (Straight; 18cm; 1×2 Teeth) | Fine Science Tools | 11024-18 |
| McPherson-Vannas Scissors (5 mm blades) | World Precision Instruments | 14124-G |
| Dumont #5 Forceps – Dumoxel Standard Tip | Fine Science Tools | 11252-30 |
| Dumont #5/45 Forceps – Dumoxel Standard Tip | Fine Science Tools | 11251-35 |
| Ultra Fine Hemostats (Straight; Smooth Inside Surfaces) | Fine Science Tools | 13020-12 |
| Powdered Activated Carbon (500 g) | Fisher Scientific | C272-500 |
| Size 6-0 Sutures with C-1 Needle (Sterile, Silk, Black, Braided , Non-absorbable; 18” Length; Box of 36) | Roboz | SUT-1073-11 |
| Reflex Clip Applier (for 9 mm clips) | World Precision Instruments | 500345 |
| 9mm Stainless Steel Reflex Clips (100/box) | World Precision Instruments | 500346 |
Animal Care:
| Name (description/quantity) | Supplier | Catalogue Number |
| 0.9% Sodium Chloride Injection (Preservative Free; 20 mL) | Hospira | 0409-4888-20 |
| Complete Homeothermic Blanket System with Flexible Probe (Medium, 115 VAC, 60 Hz) | Harvard Apparatus | 507222F |
Surgical Platform and Retractors:
(purchased at local hardware store)
| Name (description/) | Quantity |
| Stainless Steel Platform (Milled; ~12”x12”x1/8”) | 1 |
| Button Magnets (Example: Eclipse E825) | 3 |
| Stainless Steel Bolts (3” Long; Diameter Determined by Button Magnets) | 3 |
| Stainless Steel Nuts (Sized to Fit Bolts) | 9 |
| Rubber Bands (Light Tension) | 3 |
| Insect Pins (Both Ends Bent to Form Hooks) | 3 |
Semi-Thins:
| Name (description/quantity) | Supplier | Catalogue Number |
| Paraformaldehyde (1 kg) | Sigma-Aldrich | P6148-1KG |
| Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous (500 g; Used to Prepare Phosphate Buffer) | Fisher Scientific | S375-500 |
| Sodium Phosphate Monobasic Anhydrous (1 kg; Used to Prepare Phosphate Buffer) | Fisher Scientific | AC38987-0010 |
| Glutaraldehyde (50%; 10 x 10 mL) | Ted Pella, Inc. | 18431 |
| Osmium Tetroxide (4% Aqueous, 10 x 10 mL) | Ted Pella, Inc. | 18465 |
| Propylene Oxide (450 mL) | Ted Pella, Inc. | 18601 |
| Embed 812 (Kit, for hard blocks/high image contrast) | Electron Microscopy Sciences | 14120 |
| Toluidine Blue (25 g) | Ted Pella, Inc. | 19451 |
Whole Mount Muscle Preparation and Immunohistochemistry:
| Name (description/quantity) | Supplier | Catalogue Number |
| Paraformaldehyde (1 kg) | Sigma-Aldrich | P6148-1KG |
| Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous (500 g; Used to Prepare Phosphate Buffer) | Fisher Scientific | S375-500 |
| Sodium Phosphate Monobasic Anhydrous (1 kg; Used to Prepare Phosphate Buffer) | Fisher Scientific | AC38987-0010 |
| 10% BSA Diluent/Blocking Solution (200 mL) | Kirkegaard & Perry Laboratories, Inc. | 50-61-00 |
| Triton X-100 (100 mL) | Dot Scientific Incorporated | 9002-93-1 |
| Glycine, 98% (1 kg) | Fisher Scientific | AC12007-0010 |
| Tissue-Tek Cryo-OCT Compound (Case of 12; 4 oz bottles) | Fisher Scientific | 14-373-65 |
| Sylgard DOW 170 (2 lb. Kit) | Fisher Scientific | NC9492579 |
| Stainless Steel Insect Pins, Size 1 (100/pkg) | Fine Science Tools | 26001-40 |
| Tetramethylrhodamine-A-Bungarotoxin (0.5 mg) | Sigma-Aldrich | T0195-.5MG |
| Mouse Monoclonal Antibody Against SMI-312 (0.1 mL) | Covance | SMI-312R |
| Mouse Monoclonal Antibody Against SV2 (0.1 mL) | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) | SV2 |
| Rabbit Polyclonal Antibody Against GAP-43 | Novus Biologicals | NB300-143 |
| Flourescein Conjugated Goat Anti-Mouse IgG, Fcγ Subclass 1 Specific | Jackson ImmunoResearch | 115-095-205 |
| DyLight 649 Conjugated Donkey Anti-Rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch | 711-495-152 |
| 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, dilactate; 10 mg) | Invitrogen | D3571 |
| Vectashield Mounting Medium (10 mL) | Vector Laboratories | H-1000 |
| Superfrost Plus Microscope Slides (White; Size: 75 x 25 mm; Pack of 144) | Fisher Scientific | 12-550-15 |
| Fisherfinest Premium Cover Glasses (Size: 40 x 22 mm; Pack of 1 oz.) | Fisher Scientific | 12-548-5C |
References
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