Alginat mikrokapselsammensætning som en 3D-platform for Formering og differentiering af humane embryonale stamceller (embryonale) til forskellige linier
Summary
Vi har optimeret en mikroindkapslingsteknik som en effektiv 3D-platform for udbredelse og differentiering af embryonale stamceller til endoderm og dopaminerge (DA) neuroner. Det giver også mulighed for immun-isolering af celler fra værten under transplantation. Platformen kan tilpasses til andre celletyper.
Abstract
Humane embryonale stamceller (embryonale) dukker op som et attraktivt alternativ kilde til celler substitutionsterapi, eftersom de kan ekspanderes i kultur på ubestemt tid og differentieres til alle celletyper i kroppen. Forskellige typer af biomaterialer er også blevet anvendt i stamcellekulturer at tilvejebringe et mikromiljø efterligne stamcelle niche 1-3. Sidstnævnte er vigtigt for at fremme celle-til-celle-interaktion, celleproliferation og differentiering i specifikke cellelinier såvel som væv organisering ved at tilvejebringe en tredimensional (3D) miljø 4, såsom indkapsling. Princippet om celleindkapsling involverer indfangning af levende celler inden for rammerne af semi-permeable membraner i 3D kulturer 2. Disse membraner tillader udveksling af næringsstoffer, oxygen og stimuli gennem membranerne, mens antistoffer og immunceller fra værten, der er større end kapslen porestørrelsen er udelukket 5. Her har vi på forhåndsendte en tilgang til kultur og differentiere embryonale DA neuroner i en 3D-mikromiljø hjælp alginatmikrokapsler. Vi har ændret dyrkningsbetingelser 2 for at øge rentabiliteten af indkapslet embryonale. Vi har tidligere vist, at tilsætning af p160-Rho-associeret coiled-coil-kinase (klippe) inhibitor, Y-27.632 og human føtal fibroblast-konditioneret serum udskiftning medium (HFF-CM) til 3D platformen signifikant forøget overlevelse af indkapslet embryonale hvor cellerne udtrykte endelige endoderm markørgener 1. Vi har nu brugt denne 3D-platform for udbredelsen af embryonale og effektiv differentiering til DA neuroner. Protein og genekspression analyser efter den sidste fase af DA neuronal differentiering viste en forøget ekspression af tyrosinhydroxylase (TH), en markør for DA neuroner,> 100 folds efter 2 uger. Vi antager, at vores 3D-platform ved hjælp af alginatmikrokapsler kan være nyttigt at undersøge spredningen og instrueret differentieringaf embryonale til forskellige afstamninger. Dette 3D Systemet tillader også separation af foderceller fra embryonale under processen differentiering og har også potentiale til immun-isolering under transplantation i fremtiden.
Protocol
Discussion
Flere undersøgelser ved hjælp af musen embryonale stamceller og embryonale har vist fordelene ved 3D kultur system i biomaterialer og vævsmanipulering 2,3. Vi anvendte calciumalginatperler mikrokapsler som en egnet 3D platform til at studere embryonale formering og differentiering i sammenligning med barium alginat, idet embryonale signifikant højere levedygtighed, når indkapslet i calciumalginat end barium alginat. Denne kultur Systemet tillader også en høj densitet cellekultur og udveksling af nærin…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde understøttes af NHMRC Program Grant # 568.969 (PSS) og Faculty of Medicine, University of New South Wales, Stem Cell Initiative (KSS).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Notes |
| Alginate (Pronova UP MVG) | NovoMatrix | 4200101 | high glucuronic acid content ≥60%, viscosity >200 mPa s, and endotoxin <100 EU/g |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G1890-100G | |
| 0.9% NaCl | Baxter healthcare | AHF7123 | |
| Type J1 bead generator | Nisco engineering Inc | SPA-0447 | |
| Multi-Phaser syringe pump | New Era Pump Systems Inc | Model NE-1000 | |
| Ezi-Flow Medical Flowmeter | Gascon Systems | G0149 | |
| Y-27632 | Merck | 688000 | |
| Human Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A4327-1G | |
| Accutase | Millipore | SCR005 | |
| 14G x 2” I.V. catheter | Terumo | SR-OX1451C | |
| Knockout-DMEM | Invitrogen | 10829-018 | For SR medium (basal) |
| GlutaMAX -I | Invitrogen | 35050-061 | For SR medium (2 mM) |
| Knockout Serum Replacement | Invitrogen | 10828-028 | For SR medium (20%) |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15070063 | For SR medium (2.5 U/ml) |
| Insulin-Transferrin-Selenium (ITS) | Invitrogen | 41400045 | For SR medium (1x) |
| β-Mercaptoethanol | Invitrogen | 21985-023 | For SR medium (0.1 mM) |
| MEM NEAA Solution | Invitrogen | 11140-050 | For SR medium (5 mM) |
| Glasgow Minimum Essential Medium | Invitrogen | 11710035 | For DA neural differentiation medium (basal) |
| Knockout Serum Replacement | Invitrogen | 10828-028 | For DA neural differentiation medium (10%) |
| Sodium pyruvate | Invitrogen | 11360070 | For DA neural differentiation medium (1 mM) |
| MEM NEAA Solution | Invitrogen | 11140-050 | For DA neural differentiation medium (0.1 mM) |
| β-Mercaptoethanol | Invitrogen | 21985-023 | For DA neural differentiation medium (0.1 mM) |
| Sonic hedgehog (SHH) | R & D Systems | 1314-SH-025/CF | For DA neural differentiation (100 ng/ml) |
| Fibroblast growth factor 8a (FGF8a) | R & D Systems | 4745-F8-050 | For DA neural differentiation (100 ng/ml) |
References
- Chayosumrit, M., Tuch, B., Sidhu, K. Alginate microcapsule for propagation and directed differentiation of hESCs to definitive endoderm. Biomaterials. 31, 505-514 (2010).
- Dean, S. K., Yulyana, Y., Williams, G., Sidhu, K. S., Tuch, B. E. Differentiation of encapsulated embryonic stem cells after transplantation. Transplantation. 82, 1175-1184 (2006).
- Siti-Ismail, N., Bishop, A. E., Polak, J. M., Mantalaris, A. The benefit of human embryonic stem cell encapsulation for prolonged feeder-free maintenance. Biomaterials. 29, 3946-3952 (2008).
- Dawson, E., Mapili, G., Erickson, K., Taqvi, S., Roy, K. Biomaterials for stem cell differentiation. Adv. Drug Deliv. Rev. 60, 215-228 (2008).
- Orive, G. Cell encapsulation: promise and progress. Nat. Med. 9, 104-107 (2003).
- Watanabe, K. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 25, 681-686 (2007).
- Dang, S. M., Gerecht-Nir, S., Chen, J., Itskovitz-Eldor, J., Zandstra, P. W. Controlled, scalable embryonic stem cell differentiation culture. Stem Cells. 22, 275-282 (2004).
- Drukker, M. Characterization of the expression of MHC proteins in human embryonic stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 99, 9864-9869 (2002).
- Calafiore, R. Standard Technical Procedures for Microencapsulation of Human Islets for Graft into Nonimmunosuppressed Patients With Type 1 Diabetes Mellitus. Transplantation Proceedings. 38, 1156-1157 (2006).
- Cho, M. S. Highly efficient and large-scale generation of functional dopamine neurons from human embryonic stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 3392-3397 (2008).
- Vazin, T., Chen, J., Lee, C. T., Amable, R., Freed, W. J. Assessment of stromal-derived inducing activity in the generation of dopaminergic neurons from human embryonic stem cells. Stem Cells. 26, 1517-1525 (2008).
