Высокая и низкая пропускная способность экранов с галловой нематодой Meloidogyne SPP.</em

Summary

Два различных методов для выявления растений с галловой нематодой описаны. Описанные подходы включают в себя высокую пропускную способность экранов с нематодами в неразрушающем, чтобы облегчить использование этих растений в селекционных программах.

Abstract

Галловой нематоды (род Meloidogyne) являются облигатными паразитами растений. Они очень многоядны и считается одним из наиболее экономически важных растений паразитических нематод. Микроскопических второго этапа несовершеннолетних (J2), перелинявших раз в яйце, является инфекционной стадии. J2S вылупиться из яиц, свободно передвигаться в почве в течение пленка воды, и найти корень советы подходящих видов растений. После проникновения корней растений, они мигрируют к сосудистой цилиндр, где они устанавливают кормления сайт и начать кормление используя свои стилеты. Многоклеточных сайт питания состоит из нескольких увеличенных многоядерных клеток, называемых "гигантских клеток, которые образуются из клеток, прошедших митоз (повторное митоза) без цитокинеза. Соседние клетки перицикла разделяй и увеличить размер порождает типичную желчь или корневой узел, характерным симптомом галловая нематода инфекции. После кормления начинается, J2S к оседлому образу жизни и ООНдерго еще три линьки, чтобы стать взрослыми. Взрослая самка откладывает 150-250 яиц в желатиновой матрице или ниже поверхности корня. Из яйца J2S новых инфекционных люк и начать новый цикл. Галловая нематода жизненный цикл завершается в течение 4-6 недель при 26-28 ° C.

Здесь мы представляем традиционный протокол заражать растения, выращенные в горшках, с галловой нематоды и два способа высокой пропускной анализов. Первый высокой пропускной метод используется для растений с мелкими семенами, такие как томатная а второй для растений с крупными семенами, такие как вигны и фасоли. Большой семян поддерживают расширенные рост рассады с минимальной питательной добавки. Первая высокая пропускная способность анализа используются саженцы, выращенные в песок в лотки, а во втором тесте растения выращиваются в мешки в отсутствии почвы. Сумка рост проростков состоит из 15,5 х 12,5 см бумаги фитиль, сложенные в верхней сформировать 2 см глубокая ложбина, в которой семена или рассаду помещают.бумаги фитиль, содержащиеся в прозрачном пластиковом пакете. Эти пакеты позволяют роста прямых наблюдений нематод симптомы инфекции, раздражение корней и производства яиц массой, под поверхностью прозрачной сумке. Оба метода позволяют использовать экранированный растения, после фенотипирование, пересечения и семеноводства. Дополнительным преимуществом использования пакетов роста является компактность, потому что пакеты хранятся в пластиковых висит папки расположены в стойках.

Protocol

1. Томатный рост проростков в горшки и лотки Для банка тестов, завод семян помидоров в одном банке в богатой органикой почве, такие как Солнечный микс. Поддерживать в теплице при 22-28 ° C. После прорастания, удобрять раз в неделю Miracle-Gro. Около двух недель после прорастания, на двух истинно-лист этапе пересадить саженцы индивидуально в горшки (диаметром 10 см и 17 см в глубину), заполненной стерильным песчаные почвы, содержащей 90% песка и 10% органической смеси. Добавить Osmocote медленное удобрение и поддерживать в теплице при 22-28 ° С в течение двух недель. Продолжайте удобрять растения раз в неделю Miracle-Gro. Для высокой пропускной способностью экрана, семена растений непосредственно в лотки в песчаной почве, накрыть лоток с полиэтиленовой пленкой до всходов и поддерживать, как указано выше. После прорастания добавить Osmocote медленное удобрение и удобрять раз в неделю Miracle-Gro. 2. Вигны рост рассады чехлы Seeds либо прорастают в чашке Петри, выстроились в несколько слоев Kimwipe бумаги и передается отдельно в мешки или помещают непосредственно в работе паз мешочек и проросли. Поместите пакеты в пластиковую папку висит, два в папке, а также организовать папки в стойку в вертикальном положении. Установите стойку в контролируемой среде камере поддерживается при температуре 25-28 ° С и 16 часов света / 8 часов темного цикла. Стойки также могут быть сохранены в теплице, но требуют фольги или жесткой обложке документа размещен на стойке по обе стороны от стебля растения, чтобы уменьшить потенциал для грибкового загрязнения. Вода пакетов один или два раза в день с обратным осмосом воды. Около 10 до 14 дней после посева, когда адекватный корневой системой с высшим кончики корней разработал (рис. 1), рассада готова к прививки. 3. Добыча нематод яйца Добыча электроннойGGS от инфицированных корней изменяется от протокол, разработанный Хасси и Баркер (1973). Три-четыре дня до прививки нематоды, извлекать галловой нематоды яиц из зараженных корни томатов. Перед началом добычи яйцо, мыть области работы тщательно горячей водой, чтобы избежать загрязнения. Кроме того, мыть в горячей воде, блендер, два ведра, поддержка сетки, резиновый молоток, три сита 425, 90 и 25 мкм, апертура, мерный цилиндр и ножницы. Стек сита сверху вниз в следующем порядке: 425, 90 и 25 мкм диафрагмы. Яйца будут собраны на 25 мкм сито в нижней части. Положить на сито сеткой поддерживается в раковину. Поставьте ведро под проволочной сеткой, чтобы собрать прогон решение. Вырезать вершины зараженных растений (ы), используемый в качестве источника посевной, и выбросить. Осторожно выньте растение из горшка. Промойте корни путем погружения в пластиковом ведре с водой. Промойте корни в дальнейшем работатьпроточной водой, пока частицы почвы вымываются из корней. Вырезать корни ножницами на мелкие кусочки. Утилизация стержневым корнем. Положить нарезанные корни из одного растения в большие пластиковые банки с крышкой, добавьте достаточно 10% гипохлоритом натрия, чтобы покрыть корни и закройте крышку. Встряхнуть сосуд, содержащий корни в течение 2 мин. Откройте банку и залить корни на верхнее сито и промыть шланг присоединен к запотевание сопла. Промыть хорошо, пока все отбеливатель запах исчез. Используйте молоток, чтобы нажать стороны сита, чтобы избежать засорения сито поры. Снимите верхнюю сито и промыть мусора на второе сито. Удалить второе сито и собрать мелкий мусор, который включает в себя яйца, из последних сито. С струю из бутылки с водой, переместите мусора с одной стороны сито. Сбор мусора и яйца в чистый стакан с минимальным количеством воды. Сито раз больше воды, собранные введро через сито 25 мкм для сбора яиц, что, возможно, избежал. Хорошо промыть водой и собирают в одном стакане. Откажитесь от растительных остатков сверху сито и промойте все три сита с водой под давлением. Не прикасайтесь к сетке части сита, как это может привести к искажению размеров пор. 4. Инкубационные яйца нематод Линия чистых металлов с корзиной несколько слоев бумаги и Kimwipe поместиться на стеклянной посуде Петри. Разрешение 1 см расстояние между дном корзины и блюда. Залейте яйца нематод извлечены на бумаге в проволочную корзину. Добавить достаточное количество жидкости так, чтобы нижний провод корзины коснется поверхности воды, но не погружается в воду. Накрыть сверху пластиковой крышкой. Каждый день проверки испарение воды и добавьте немного воды в чашке Петри, чтобы дно корзины касается воды. Это позволит предотвратить яйцо от высыхания. Через день, собирать ватер, который содержит J2S из чашки Петри в стакан. Если не используется сразу, проветрить собранные посевной при комнатной температуре на поставку лаборатории воздух или порожденные аквариум насосом. Используйте газированные посевной в течение 2 дней. J2S может быть собрана из инкубационных создан в течение 6-8 дней. 5. Томатный корневой инфекции в горшки или лотки и оценка инфекции Используйте три порции собранных нематод для подсчета количества J2S в подсчете слайдов или блюдо, рассчитать среднее и определить необходимый объем для посева. Обычно 3000 J2S используются на заводе в горшках и 500 J2S для растений, выращиваемых в рассада лотков. Движение посевного материала на магнитной мешалкой пластины на низкой скорости. Перед тем, как прививать растения, убедитесь, что почва влажная, но не слишком влажным. Для банка прививка, сделать три отверстия около половины горшка глубины в песок вокруг каждой системы помидор корень с помощью карандаша (рис. 2 </сильный>). Инокулировать каждого растения, обеспечивая J2S на три отверстия с помощью пипетки. После этого закройте отверстия. Для высокой пропускной способностью экраны в лотки, использовать модифицированную запечатанных иглы с отверстиями по бокам приклеены к 5 мл пипетки по pipetter (рис. 3) для доставки J2S в почву. Кроме того, нематоды могут быть поставлены как в пункте 5.3. Поддержание растений в теплице при 24-27 ° C в течение шести-восьми недель. Продолжайте удобрять два раза в месяц с Miracle-Gro. Для оценки инфекции, осторожно удалите растения из горшков и промыть корни (как описано в пункте 3.3). Пятно кладок синего, погружая корни в 1 мг / л erioglaucine, в течение 15 мин. Промойте корни в воде и оценить путем подсчета окрашенных масс яйца на отдельные корневой системой. Освещенный стол лупы могут быть использованы, чтобы помочь себе яйцо масс. Если экранированный растений, необходимых для дальнейшего гenetic исследования, не режут вершины до мытья корни для оценки. После окрашивания и подсчета кладок, пересаживать рассаду в почву органических, чернослив вершины сильно уменьшить испарение, и поддерживать в теплице. 6. Вигны корневой инфекции в чехлы и оценка инфекции Подсчитайте нематода посевной и перемешать на магнитной перемешивающей пластине, как описано выше. Удаление пакетов из висящих папок и места на горизонтальной поверхности. Инокулировать каждый мешочек с 1500 J2S в 5 мл. Снимите пластиковую крышку сумки и распространения нематоды равномерно по поверхности корней. Хранить мешки в горизонтальном положении в течение 24 часов после прививки, покрытая темной бумагой, чтобы исключить свет, а затем вернуться к висит папки в ростовой камере. Вода растения по мере необходимости, один или два раза в день, причем половина-ного раствора Хогланда (Хогланд и Арнон, 1950; Таблица 1 </сильный>), пока в ответ на удобрения наблюдается, как правило, расширение озеленения листвы и более энергичные роста побегов. Обычно растения поливают с половиной прочности Хогланд 3 дня подряд. После этого, держите мешки влажным водой. Примерно 30 дней (диапазон 28-35 дней) после заражения, настаивать каждый мешок с 10-20 мл 75 мг / л erioglaucine. Хранить мешки затопления с красителем в горизонтальном положении всю ночь. Слейте мешки и оценить корневой системы путем подсчета кладок под лупой освещенный стол. Если экранированный растений, необходимых для дальнейшего генетического исследования или племенной работы, тщательно вытащить корни из бумаги, пересадка в почву органических в горшках и поддерживать в теплице. 7. Представитель Результаты Соответствующих стадиях томатов и растений вигны для нематод прививки для двух систем, описанных показаны на рисунках1 и 2. Кроме того, примеры хорошо-инфицированных корней томатов и вигны показаны на рисунках 4 и 5. Как и в большинстве экранов устойчивость к заболеваниям, рекомендуется использовать как минимум 6-10 растений на генотип для нематод прививка для расчета средней скорости инфекции. Изменение нематода инфекции между растениями, одного и того же генотипа, может быть уменьшена с помощью одинакового размера завода и точная сумма и доставка посевной. Использование лотков и рост пакетов позволяет скрининга сотен до нескольких тысяч растений на небольшом пространстве роста. Рост пакетов также позволит быстро и эффективно неразрушающего контроля с галловой нематодой инфекции без необходимости для мытья корни (рис. 4). Рисунок 1. Двухнедельной давности вигны растения, выращенные в сумку и готова к галловых нематодэ прививки. Рисунок 2. Трехнедельной давности томатный завод готов к галловой нематоде прививки. Рисунок 3. Изменение иглы и пипетки для высокой пропускной способности прививки нематод. В нижней части иглы был запечатан и три набора отверстий были пробурены в иглу с помощью лазерного луча. Тогда изменение игла была приклеена к 5 мл кончике пипетки. Рисунок 4. Система помидор корень заражены галловой нематоды. Рисунок 5. Система вигны корень с яйцом массы окрашиваются erioglaucine 30 дней после прививки, выращенных при28 ° C.

Discussion

Есть два важных шагов для успешной экран нематод: подготовка высоко посевной инфекционных и использование растений в надлежащем стадии развития. Штриховка скорость галловой нематоды яиц сильно варьирует и составляет от 5 – 50%. Поэтому для получения оптимального уровня люка, и очень J2S инфекционный, пристальное внимание должно быть обращено на добычу и яйцо инкубационное процедур. Яйца должны подвергаться отбеливателя в течение минимального периода времени и отбеливания следует промыть и от корня смеси. Когда инкубационных яиц, суспензии, содержащей яйца не должны быть погружены в воду. Кроме того, во избежание попадания яйца в основной чашке Петри, где вылупился несовершеннолетних собираются. Один из способов избежать попадания яиц в инкубационные процесс не добавлять воду непосредственно в Kimwipe как бумага может сломаться. Вместо того, чтобы добавить воды непосредственно в чашку Петри.

Для достижения наилучшего результата, используйте только что вылупившихся J2S. Если hatcч низка и более посевной необходимо, J2S можно хранить при температуре 15 ° С в течение длительного периода времени. Теплый хранить посевной до комнатной температуры, чтобы возродить нематод до прививки. Тем не менее, не храним J2S в течение длительного времени даже при 15 ° С, как голод J2S не заразить эффективно.

Молодые саженцы лучшие стадии развития для галловая нематода прививки. Тем не менее, это должно быть сбалансировано с формированием адекватной корневой системы обеспечения достаточного количества кончиков корней в качестве точки входа для J2S. Поддержание оптимальных условий роста растений также имеет важное значение для экранов. Избегайте чрезмерного полива растений, специально выращенных в мешки. Чрезмерное орошение сумки, как указано стоячей воды на дне сумки, может способствовать росту грибковых и уменьшить корень здоровья.

В обоих тестах дальнейшей оценки нематода инфекции и расчет количества яиц / корневой системы и яиц / грамм частотыш корень может быть выполнена. Для томатного анализы, отдельные корни взвешивают и яйца извлекается как описано для посевной подготовки (раздел 3). При обработке большого числа проб растений, отдельные корневые системы может быть использование измельчаются в блендере яйца для добычи. Число яиц, следует считать, по крайней мере, три порции и яиц / грамм свежих корневая система рассчитана. В сумке анализы, корневая система снял бумажным вкладышем, вес и яйца извлекается.

Materials

Compound	Concentration
KNO3	5 mM
Ca(NO3)2 • 4 H2O	5 mM
MgSO4 • 7H2O	2 mM
KH2PO4	1 mM
Hamp-ene Fe EDTA 13.0%	1 mM
H3BO3	46 μM
MnCl2 • 4H2O	9 μM
ZnSO4 • 7H2O	0.00076 μM
CuSO4 • 5H2O	0.00032 μM
(NH4)6Mo7O24 • 4H2O	0.00016 μM

Table 1. Reagents for Hoagland’s solution.

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments
Erioglaucine	Fisher	AC22973-0250
Miracle-Gro for tomato	Scotts Miracle-Gro		18-18-21
Osmocote	Scotts Miracle-Gro
Seedling growth pouches	Mega International
Sieve 25 μm	H & C Sieving Systems	3886	US standard #500
Sieve 90 μm	H & C Sieving Systems	3880	US standard #170
Sieve 425 μm	H & C Sieving Systems	3871	US standard #40
Sunshine mix	Sun Gro Horticulture Canada

Table 2. Table of specific reagents and equipment.