To forskellige metoder til skærmen anlæg med rodgallenematoder er beskrevet. De beskrevne tilgange omfatter high-throughput skærme med nematoder på en destruktiv måde at fremme brugen af disse anlæg i avlsprogrammer.
Rodgallenematoder (slægten Meloidogyne) er obligate plante parasitter. De er ekstremt polyphagous og betragtes som en af de mest økonomisk vigtige planter nematoder. Den mikroskopiske andet trin juvenil (J2), molted gang i ægget, er det infektive fase. De J2s klækker fra æggene, bevæge sig frit i jorden inden for en film af vand, og find rodspidserne af egnede plantearter. Efter trænger planten rod, vandrer de mod vaskulære cylinder, hvor de etablerer en fodring websted og indlede fodre bruger deres stiletter. Den flercellet fodring stedet består af flere forstørrede multinucleare celler kaldet 'kæmpeceller', som er dannet ud fra celler, der undergik karyokinesis (gentaget mitose) uden cytokinese. Omkringliggende pericycle cellerne deler sig og vokse i størrelse giver anledning til en typisk galde eller rod knude, de karakteristiske symptomer på rodgallenematode infektion. Når fodring er initieret, J2s bliver stillesiddende og undergo yderligere tre molts at blive voksne. Den voksne hun lægger 150-250 æg i en gelatinøs matrix på eller under overfladen af roden. Fra æggene nye smitsomme J2s klække og starte en ny cyklus. Den rodgallenematode livscyklus er afsluttet i 4-6 uger ved 26-28 ° C.
Her præsenterer vi den traditionelle protokollen til at inficere planter, der dyrkes i potter, med rodgallenematoder og to metoder til high-throughput analyser. Den første high-throughput metode til anlæg med små frø som tomat, mens den anden er for planter med store frø som cowpea og fælles bønner. Store frø understøtte udvidet frøplante vækst med minimal kosttilskud. Den første high throughput assay udnytter planter dyrket i sand i skuffer, mens der i andet assay planterne dyrkes i poser i mangel af jorden. Den vækst af frøplanter pose er fremstillet af en 15,5 x 12,5 cm papir væge, foldes på toppen at danne en 2 cm dyb rende, i hvilken frø eller kimplanter er placeret. Denpapir væge er indeholdt inden i en transparent plastpose. Disse vækstfaktorer poser muliggøre direkte observation af nematodeinfektion symptomer, rivning af rødder og æg masseproduktion, under overfladen af et transparent lomme. Begge metoder muliggør anvendelse af de screenede planterne efter fænotypebestemmelse for passage eller frøproduktion. En yderligere fordel ved anvendelse af vækst poser er lille pladsbehov for poserne opbevares i plast hængende mapper anbragt i stativer.
Der er to vigtige trin for en vellykket nematode skærm: Fremstilling af en stærkt smitsom inokulum og anvendelse planter på den korrekte udviklingsstadium. Skravering på rodgallenematode æg er meget varierende og spænder mellem 5 – 50%. Derfor for at opnå optimale niveauer af Hatch og stærkt smitsomme J2s, skal meget opmærksom på ægget udvinding og rugeæg procedurer. Æg skal udsættes for blege for et minimum periode og blegemiddel skal skylles godt ud fra roden blandingen. Når klækningen æggene, skal gyllen indeholder æg ikke nedsænkes i vand. Hertil kommer, at undgå at spilde æggene ind i den underliggende petriskål, hvor de udklækkede unger er samlet. En måde at undgå spild af æggene under udrugningsprocessen er ikke at tilsætte vand direkte til Kimwipe som papir kan knække. Stedet tilsættes vand direkte til petriskålen.
For de bedste resultater ved at bruge frisk udklækkede J2s. Hvis hatch er lav og mere inokulum er nødvendigt, kan J2s opbevares ved 15 ° C i en længere periode. Opvarme den lagrede inokulum til stuetemperatur for at genoplive nematoder før inokulering. Du skal dog ikke gemme J2s i længere perioder selv ved 15 ° C som udsultede J2s ikke vil inficere effektivt.
Unge kimplanter er den bedste udviklingsstadiet for rodgallenematode inokulering. Men det skal være afbalanceret med dannelsen af et passende rodsystem giver et tilstrækkeligt antal rodspidserne som indgangssteder for de J2s. Opretholdelse af optimal plantevækst betingelse er også kritisk for skærmene. Undgå over-Vanding af planter specielt dem, der dyrkes i poser. Over-vanding af poser, som angivet ved stillestående vand i bunden af posen, kan fremme svampevækst og mindsker rod sundhed.
Med både analyser yderligere evaluering af nematodeinfektion og beregning af antallet af æg / rodsystem og æg / gram fresh rod kan udføres. For tomat analyser, er de enkelte rødder vejet og udtrukne æg som beskrevet for inokulum forberedelse (afsnit 3). Ved behandling af stort antal af plantebeskyttelsesmidler prøver, kan de enkelte rodsystemer blive udblødt hjælp af en blender for æg ekstraktion. Antallet af æg bør tælles i mindst tre portioner og æg / gram frisk rodsystemet beregnes. For posen assays rodsystemet trækkes papiret insert, vejet, og æggene blev ekstraheret.
The authors have nothing to disclose.
Forskning i Kaloshian Lab er finansieret af en bevilling fra United States National Institute of Levnedsmiddel-og Landbrugsorganisation (2007-35607-17765). Forskning i Roberts Lab er finansieret af tilskud fra United States Agency for International Development (GDG-G-00-02-00012-00 og EDH-A-00-07-00005) og California Dry Bean Advisory Board.
Compound | Concentration |
KNO3 | 5 mM |
Ca(NO3)2 • 4 H2O | 5 mM |
MgSO4 • 7H2O | 2 mM |
KH2PO4 | 1 mM |
Hamp-ene Fe EDTA 13.0% | 1 mM |
H3BO3 | 46 μM |
MnCl2 • 4H2O | 9 μM |
ZnSO4 • 7H2O | 0.00076 μM |
CuSO4 • 5H2O | 0.00032 μM |
(NH4)6Mo7O24 • 4H2O | 0.00016 μM |
Table 1. Reagents for Hoagland’s solution.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
Erioglaucine | Fisher | AC22973-0250 | |
Miracle-Gro for tomato | Scotts Miracle-Gro | 18-18-21 | |
Osmocote | Scotts Miracle-Gro | ||
Seedling growth pouches | Mega International | ||
Sieve 25 μm | H & C Sieving Systems | 3886 | US standard #500 |
Sieve 90 μm | H & C Sieving Systems | 3880 | US standard #170 |
Sieve 425 μm | H & C Sieving Systems | 3871 | US standard #40 |
Sunshine mix | Sun Gro Horticulture Canada |
Table 2. Table of specific reagents and equipment.