To forskjellige metoder til skjermen planter med rot-knuten nematoder er beskrevet. De beskrevne tilnærminger inkluderer high-throughput skjermer med nematoder i en destruktiv måte legge til rette for bruken av disse plantene i avlsprogram.
Root-knuten nematoder (slekten Meloidogyne) er obligate plante parasitter. De er ekstremt polyphagous og regnes som en av de mest økonomisk viktige planter kveis. Den mikroskopiske andre-etappe juvenil (J2), molted gang i egg, er infeksiøs scenen. De J2s klekkes fra eggene, bevege seg fritt i jord innen en film av vann, og finn root tips om egnede plantearter. Etter trenger inn i planten rot, vandrer de mot vaskulære sylinderen der de etablere en fôring nettsted og initiere fôring bruke sine stylets. Den flercellet fôring området består av flere forstørrede multinuclear celler kalt 'gigantiske celler' som dannes fra celler som gjennomgikk karyokinesis (gjentatt mitose) uten cytokinese. Nabolandene pericycle celler deler og forstørre i størrelsen gir opphav til en typisk galle eller rot knute, den karakteristiske symptomet på root-knot nematode infeksjon. Når fôring initieres, J2s blir stillesittende og undergo tre ekstra molts å bli voksne. Den voksne hunnen legger 150-250 egg i en geléaktig matrise på eller under overflaten av roten. Fra eggene nye infeksiøs J2s klekkes og starter en ny syklus. Roten-knute nematode livssyklus er fullført i 4-6 uker ved 26-28 ° C.
Her presenterer vi den tradisjonelle protokollen til å infisere planter, dyrket i potter, med root-knuten nematoder og to metoder for high-throughput analyser. Den første high-throughput metoden brukes for planter med små frø som tomat, mens andre er for planter med store frø som cowpea og felles bønne. Store frø støtte utvidet frøplante vekst med minimal næringsinnhold supplement. Den første high throughput analysen benytter frøplanter dyrket i sand i skuffene mens i den andre analysen plantene er dyrket i poser i fravær av jord. Frøplante veksten posen er laget av en 15,5 x 12.5cm papir veken, brettet øverst for å danne en 2-cm dyp gjennom der frøet eller spiren er plassert. Detpapir veke finnes inne i en gjennomsiktig plast pose. Disse vekst poser tillate direkte observasjon av nematode infeksjon symptomer, riving av røtter og egg masseproduksjon, under overflaten av en gjennomsiktig pose. Begge metodene tillate bruk av de skjermede plantene, etter phenotyping, for kryssende eller frøproduksjon. En ekstra fordel av bruken av veksten poser er det lite plassbehov fordi posene lagres i plast hengende mapper arrangert i rack.
Det er to viktige skritt for en vellykket nematode skjerm: Utarbeidelse av en svært smittsomme podestoff og bruke planter på riktig utviklingsstadiet. Klekking frekvensen av rot-knuten nematode egg er svært variabel og varierer mellom 5 – 50%. Derfor å oppnå optimale nivåer av luke og svært smittsomme J2s, må nøye betales til egg uttak og klekking prosedyrer. Egg bør utsettes for blekemiddel i minimum tidsperiode og blekemiddel bør skylles godt ut fra roten blandingen. Når klekke eggene, bør slurry som inneholder eggene ikke dyppes i vann. I tillegg unngå å søle eggene inn i underliggende petriskål der klekket yngel er samlet. En måte å unngå å søle eggene under klekking prosessen er ikke å legge vann direkte til Kimwipe som papiret skulle bryte. I stedet legger vannet direkte til petriskål.
For best resultat, bruk fersk klekket J2s. Dersom hatch er lav og mer podestoff er nødvendig, kan J2s lagres ved 15 ° C for en lengre periode. Varm den lagrede podestoff til romtemperatur for å gjenopplive de nematoder før inokulasjon. Men ikke lagre J2s for lengre perioder, selv ved 15 ° C som sultet J2s ikke vil infisere effektivt.
Unge frøplanter er det beste utviklingsstadiet for root-knot nematode inokulasjon. Imidlertid må dette være balanserte med dannelsen av et tilstrekkelig rotsystem som gir et tilstrekkelig antall rot tips som innganger for J2s. Opprettholde optimal plantevekst tilstand er også kritisk for skjermene. Unngå over-vanning planter spesielt de dyrket i poser. Over-vanne poser, som indikert av stillestående vann i bunnen av posen, kan fremme soppvekst og redusere rot helse.
Med både analyser videre evaluering av nematode infeksjon og beregning av antall egg / rotsystem og egg / gram av fresh root kan utføres. For tomat analysene, er individuelle røtter veies og egg ekstrahert som beskrevet for podestoff forberedelse (§ 3). Ved behandling stort antall plante prøver, kan enkelte rotsystemer bli macerated bruke en blender for egg utvinning. Antall egg som skal regnes i minst tre alikvoter og eggene / gram fersk rotsystem beregnet. For posen analysene, er rotsystemet dro av papiret sette inn, veid, og egg ut.
The authors have nothing to disclose.
Forskning i Kaloshian lab er finansiert av en bevilgning fra United States National Institute of Food and Agriculture (2007-35607-17765). Forskning i Roberts lab er finansiert med tilskudd fra USA Agency for International Development (GDG-G-00-02-00012-00 og EDH-A-00-07-00005) og California Dry Bean Advisory Board.
Compound | Concentration |
KNO3 | 5 mM |
Ca(NO3)2 • 4 H2O | 5 mM |
MgSO4 • 7H2O | 2 mM |
KH2PO4 | 1 mM |
Hamp-ene Fe EDTA 13.0% | 1 mM |
H3BO3 | 46 μM |
MnCl2 • 4H2O | 9 μM |
ZnSO4 • 7H2O | 0.00076 μM |
CuSO4 • 5H2O | 0.00032 μM |
(NH4)6Mo7O24 • 4H2O | 0.00016 μM |
Table 1. Reagents for Hoagland’s solution.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
Erioglaucine | Fisher | AC22973-0250 | |
Miracle-Gro for tomato | Scotts Miracle-Gro | 18-18-21 | |
Osmocote | Scotts Miracle-Gro | ||
Seedling growth pouches | Mega International | ||
Sieve 25 μm | H & C Sieving Systems | 3886 | US standard #500 |
Sieve 90 μm | H & C Sieving Systems | 3880 | US standard #170 |
Sieve 425 μm | H & C Sieving Systems | 3871 | US standard #40 |
Sunshine mix | Sun Gro Horticulture Canada |
Table 2. Table of specific reagents and equipment.