Två metoder för att screena växter med rotknölnematoder beskrivs. De beskrivna metoder innefattar hög genomströmning skärmar med nematoder i en icke-förstörande sätt att underlätta användningen av dessa växter i avelsprogram.
Rotknölnematoder (släktet Meloidogyne) är obligata växtparasiter. De är extremt polyphagous och anses vara en av de ekonomiskt viktiga växtparasitiska nematoder. Den mikroskopiska andra stegets juvenil (J2), molted gång i ägg, är det infektiösa stadiet. De J2S kläcks ur äggen, röra sig fritt i jorden inom en film av vatten och leta rotspetsar på lämpliga växtarter. Efter att tränga in i växtrötter, vandrar de mot vaskulära cylindern där de skapa en matning plats och påbörja utfodring med sina nålar. Den flercelliga matningsstället består av flera förstorade multinukleära celler kallade jätteceller 'som är bildade från celler som undergick karyokinesis (upprepad mitos) utan cytokines. Angränsande pericycle celler delar och förstora i storlek ger upphov till en typisk galla eller rot knut, de karakteristiska symtomen på root-knot nematod infektion. När utfodring initieras, J2S blir stillasittande och undergo ytterligare tre molts att bli vuxna. Den vuxna honan lägger 150-250 ägg i en gelatinartad matris på eller under ytan av roten. Från äggen nya infektiösa J2S kläcks och starta en ny cykel. Roten-knot nematod livscykel är klar i 4-6 veckor vid 26-28 ° C.
Här presenterar vi den traditionella protokollet att infektera växter, som odlas i krukor med rotknölnematoder och två metoder för high-throughput analyser. Den första high-throughput metod används för anläggningar med små frön som tomat, medan den andra är för växter med stora frön som cowpea och gemensamma bönor. Stora frön stödjer utökade planta tillväxt med minimal näringstillskott. Den första hög genomströmning analysen använder plantorna odlas i sand i lådor medan den andra analysplattan växterna odlas i påsar i frånvaro av jorden. Plantan tillväxten påsen är gjord av en 15,5 x 12,5 cm papper veke, vek i toppen för att bilda en 2-cm-djupa tråg i vilken fröna eller plantan är placerad. Denpapper veke finns inuti en genomskinlig plastpåse. Dessa tillväxt påsar medger direkt observation av symtom nematodinfektion, hopskärning rötter och ägg massproduktion, under ytan av en transparent påse. Båda metoderna kan användningen av kontrollerade anläggningarna efter fenotypning för korsande eller produktion av utsäde. En ytterligare fördel med användningen av tillväxtfaktorer påsar är litet utrymmesbehov eftersom påsarna är lagrade i plast som hänger mappar anordnade i ställningarna.
Det finns två viktiga steg för en lyckad nematod skärmen: utarbetandet av ett mycket smittsamt inokulat och använda växter på rätt utvecklingsstadium. Kläckning hastighet av rotknölnematoder nematodägg är mycket variabel och uppgår till mellan 5 till 50%. Därför att erhålla optimala nivåer av luckan och starkt J2S infektiösa, måste stänga hänsyn tas till ägget utvinning-och kläckning. Ägg bör utsättas för blekmedel för en minsta tidsperiod och blekmedel bör sköljas väl ut från roten blandningen. När kläckningen av ägg bör slammet innehåller ägg inte nedsänkt i vatten. Dessutom undvika att spilla äggen i den underliggande petriskålen där kläckta yngel samlas in. Ett sätt att undvika att spilla äggen under kläckning processen är inte att lägga till vattnet direkt till Kimwipe som papper kan gå sönder. Istället lägger vattnet direkt till petriskål.
För bästa resultat, använd nyligen kläckta J2S. Om hatch-graden är låg och mer inokulum behövs kan J2S lagras vid 15 ° C under en längre period. Värma den lagrade inokulum till rumstemperatur för att återuppliva nematoderna före ympningen. Men inte lagrar J2S under långa perioder, även vid 15 ° C som svalt J2S inte smitta effektivt.
Unga plantor är det bästa utvecklingsstadiet för root-knot nematod ympning. Behöver dock vägas mot bildandet av ett lämpligt rotsystem som kan ge tillräckliga mängder root tips som införselplatser för J2S. Bibehålla optimal kondition växters tillväxt är också kritisk för skärmar. Undvik att vattnas plantorna speciellt de som odlas i påsar. Över-vattning av påsarna, vilket indikeras av stående vatten på bottnen av påsen, kan främja svamptillväxt och minskar rot hälsa.
Med både analyser ytterligare utvärdering av nematodinfektion och beräkning av antalet ägg / rotsystem och ägg / gram fresh rot kan utföras. För tomat analyserna, individuella rötter vägs och extraherade ägg som beskrivits för inokulat beredning (avsnitt 3). Vid bearbetning av ett stort antal växt prover, kan enskilda rotsystem kan urlakade med en mixer för ägg extraktion. Antalet ägg bör räknas i minst tre portioner och äggen / gram färsk rotsystem beräknas. För påsen analyserna, rotsystemet dras av papper insatsen, vägdes och ägg extraheras.
The authors have nothing to disclose.
Forskning i Kaloshian lab finansieras genom ett bidrag från USA National Institute of Food och jordbruksorganisation (2007-35607-17765). Forskning i Roberts lab finansieras genom anslag från USA Agency for International Development (GDG-G-00-02-00012-00 och EDH-A-00-07-00005) och California Dry Bean Advisory Board.
Compound | Concentration |
KNO3 | 5 mM |
Ca(NO3)2 • 4 H2O | 5 mM |
MgSO4 • 7H2O | 2 mM |
KH2PO4 | 1 mM |
Hamp-ene Fe EDTA 13.0% | 1 mM |
H3BO3 | 46 μM |
MnCl2 • 4H2O | 9 μM |
ZnSO4 • 7H2O | 0.00076 μM |
CuSO4 • 5H2O | 0.00032 μM |
(NH4)6Mo7O24 • 4H2O | 0.00016 μM |
Table 1. Reagents for Hoagland’s solution.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
Erioglaucine | Fisher | AC22973-0250 | |
Miracle-Gro for tomato | Scotts Miracle-Gro | 18-18-21 | |
Osmocote | Scotts Miracle-Gro | ||
Seedling growth pouches | Mega International | ||
Sieve 25 μm | H & C Sieving Systems | 3886 | US standard #500 |
Sieve 90 μm | H & C Sieving Systems | 3880 | US standard #170 |
Sieve 425 μm | H & C Sieving Systems | 3871 | US standard #40 |
Sunshine mix | Sun Gro Horticulture Canada |
Table 2. Table of specific reagents and equipment.