Vi en protokol til dyrkning af højrenset hippocampale neuroner fra prænatal musehjerner uden anvendelse af en føder gliacelle lag.
Primære kulturer af rotte-og murin hippocampale neuroner er almindeligt anvendt til at afsløre cellulære mekanismer neurobiologi. Ved at isolere og voksende individuelle neuroner, er forskere i stand til at analysere egenskaber i forbindelse med cellulære handel cellestruktur og individuelle protein lokalisering ved hjælp af en række af biokemiske teknikker. Resultater fra sådanne forsøg er afgørende for at teste teorier der vedrører den neurale basis for hukommelse og indlæring. Imidlertid er utvetydige resultater fra disse former af eksperimenter baseret på evnen til at vokse neuronale kulturer med minimal kontaminering fra andre hjerneregioner celletyper. I denne protokol, bruger vi bestemte medier, designet til neuron vækst og omhyggelig dissektion af embryonale hippocampalt væv til at optimere væksten af sunde neuroner og samtidig minimere forurenende celletyper (dvs. astrocytter). Embryonisk mus hippocampalt væv kan være vanskeligere at isolere end tilsvarende gnaver væv på grund af størrelsen af prøven for dissection. Vi viser detaljerede dissektion teknikker hippocampus fra embryonale dag 19 (E19) museunger. Når hippocampalt væv isoleres, er skånsom dissociation af neuronale celler opnået med en fortyndet koncentration af trypsin og mekanisk sprængning konstrueret til at adskille celler fra bindevævet samtidig med minimal beskadigelse af de enkelte celler. En detaljeret beskrivelse af, hvordan man forbereder pipetter, der anvendes i forstyrrelsen er inkluderet. Optimale plettering tætheder er fastsat for immuno-fluorescens-protokoller til at maksimere succes cellekultur. Protokollen tilvejebringer en hurtig (ca. 2 timer) og effektiv teknik til dyrkning af neuronale celler fra mus hippocampalt væv.
Hippocampale kulturer er blevet anvendt i molekylærbiologi i mere end 20 år. Mens der i princippet kan neuronale kulturer fremstilles af en del af hjernen, har hippocampale kulturer vist sig at være den mest populære på grund af den relativt enkle opbygning af nerve-cellepopulation i hippocampus 7. Hippocampus kulturer er typisk fremstillet af senfase fostervæv. Dette væv er lettere at dissociere og indeholder færre gliaceller, end modent hjernevæv 1. Isolering af hippocampale neuroner fra…
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Dr. Michael Wooten for hans hjælp i udarbejdelsen af manuskriptet. Dette arbejde blev støttet af NIH 2RO1NS033661 (MWW).
Name of Reagent | Vendor | Catalog Number |
Rat Tail Collagen 1 | BD Biosciences | 354236 |
Poly-D-lysine Solution | Chemicon | A-003-E |
Hanks Balanced Salt Solution | Invitrogen | 14175-095 |
Trypsin Solution (1X) 0.25%, liquid | Invitrogen | 15050-065 |
NeuroBasal Medium (1X) liquid | Invitrogen | 21103-049 |
B27 Supplement (50X) liquid | Invitrogen | 17504-044 |
L-Glutamine 200 mM (100X) liquid | Invitrogen | 25030-149 |
Penicillin (10,000 units/ml) / Streptomycin (10,000 μg/ml) | Invitrogen | 15140-148 |
HI-Donor Horse Serum | Atlanta Biologicals | S12150H |